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链霉素发酵工艺验证方案
1.
目的：
确认链霉素发酵系统工艺流程，确认种子工艺、小小罐工艺、小罐工艺、中罐工艺、大罐发酵工艺，验证该发酵系统工艺的稳定性和可靠性及制备 的发酵液能否达到中间体规格要求。
2. 范围：
此方案包括一个50吨大罐链霉素发酵液的生产过程。
2.1 验证地点：
403车间发酵工段：
2.2 验证对象： 2.2.1 原斜面
2.2.2 代1、代2斜面 2.2.3 母瓶 2.2.4 子瓶 2.2.5 小小罐 2.2.6 小罐 2.2.7 中罐 2.2.8 大罐
2.3 验证步骤：
确定验证方案，确定验证计划，内容、步骤，以便准确验证链霉素发酵系统。
3. 验证措施概要： 3.1 生产记录：
原斜面：冷藏期≤10天
外观无菌
外观集落:白色丰满、正常
代1或代2斜面：冷藏期≤14天
外观无菌
外观集落：白色丰满、正常
母瓶：无菌斜面及外观无菌
菌丝粘稠、色泽米黄、无颗粒状菌丝 效价68小时≥1700u/ml 效价96小时≥3500u/ml 效价120小时≥6700u/ml 冷藏期≤5天 菌龄50~64小时 菌丝II—III
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子瓶：无菌斜面及外观无菌
菌丝粘稠、色泽米黄、无颗粒状菌丝 效价120小时≥7000u/ml 效价144小时≥7500u/ml 冷藏期≤7天 菌龄30~44小时 菌丝II—III
小小罐：菌丝II—III
镜检无菌
放罐效价≥800u/ml，残C≤3.5g/100ml，残N≤140mg/100ml，PH≤7.5
小罐：菌丝II—III
镜检无菌
放罐效价≥1200u/ml，残C≤3.5g/100ml，残N≤140mg/100ml， PH≤7.5
中罐：菌丝II—III
镜检无菌
放罐效价≥1800u/ml，残C≤3.5g/100ml，残N≤140mg/100ml， PH≤7.5
大罐：放罐残糖≤2.0克/100毫升
放罐残氮≤120毫克/100毫升 放罐透光度≥40%
放罐效价≥14000u/ml
3.2 原材料：
生产过程中所用的各种原材料及其规格（见原材料一览表）
3.3 设备：
生产链霉素所及设备见设备一览表。
3.4 以上所及设备的每一部分，必须在本次验证前确保经过适当鉴定
（IQ/OQ），并且任何相关的测试装置经过校正。
3.5 人员培训，作为验证研究的一部分，涉及生产链霉素发酵的每位职工
均经GMP及有关岗位SOP培训。
4. 生产程序和流程表： 4.1 生产过程的描述：
4.1.1 我厂用于生物合成链霉素的生产菌种为灰色链霉菌，为了保持菌种的
生命活力和稳定性，将孢子保存于干燥的沙土内冷藏在2~4℃冰库内，或者将孢子制成牛奶悬浊液，密闭冷藏于～196℃液氮中。
每年对生产菌株进行两次自然分离，控制菌落变异率≤5%，并进行菌丝八代遗传稳定性考查，考查其母、子代谢及效价单位的稳定性。
挖取清洁海滩细沙（不能污染各种有机物），用自来水漂洗清洁，
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洗至漂出来的水澄清不浑浊为止，烘干、100目筛子过筛，用磁铁充分吸尽砂内铁屑备用，挖取郊区地面二尺深处的黄土（不能污染各种有机物），用自来水充分漂洗消毒，洗至漂出来的水澄清为止，烘干，120目筛子过筛,用磁铁充分吸尽土内铁屑备用。以上处理的砂和土，按土一份，砂二份比例混合，分装于玻璃试管（12×100mm），每支装1g，用纱布棉塞塞紧置于小铜线筐中，放消毒锅消毒，间歇灭菌三次，每次压力0.12MPa，温度122℃，时间1小时，消毒后置电烘箱烘干，110～120℃、4－5小时，外表明批号、日期备用，使用前为确保无菌起见，应按以上要求再消毒烘干一次。
取符合质量要求的孢子斜面一支，在无菌操作下,加入0.85%氯化钠无菌生理盐水1ml左右，用1#棒将表面孢子轻轻刮下（防止用力过重划破琼脂）摇匀，用1ml割头无菌吸管吸出，准确仔细地在每支无菌空白砂土管内加0.1ml孢子液（加入时应注意将吸管伸至接近沙土处，但又不能接触沙土，也不能使吸管口接触沙土管口及内壁）。塞紧棉塞，将沙土敲松摊开，放在真空干燥器内（干燥器内放置氯化钙干燥剂）保持真空度0.10MPa，抽4支时维持抽干4小时，抽5支或以上时，抽干时间酌情增加，取出抽干的沙土孢子，敲松放在盛有无水氯化钙的广口瓶中盖紧密封，放2～4℃冰库中保存备用。使用时采用干接法接种。孢子沙土管有效使用期为2年。
市售新鲜牛奶离心三次，3000rpm,15分钟弃去上层脂肪,将脱脂牛奶置试管内115℃～117℃，0.07MPa，15－20分钟消毒。
将空白安培管洗净烘干，塞好棉花，置于消毒锅内121℃，60分钟，间隙灭菌三次，待用。
取符合质量要求的孢子斜面一支，加入无菌脱脂牛奶5～10ml，用2#棒轻轻将孢子刮下，用无菌吸管吸孢子牛奶悬浊液置灭菌珠子瓶，振摇10分钟,然后用1ml 无菌吸管将珠子瓶内的孢子牛奶悬浊液加入无菌安培管中，0.3ml/支，做好标记存置于液氮中保存，存放有效期5年。
4.1.2 种子组洁净工作台洁净等级100级，每三个月对尘埃粒子（≥0.5u的
尘埃≤3.5粒/1L空气）、风速（≥0.35m/s）、无菌（定点开启双碟30分钟≤1个/碟）进行测定。平时每次操作定点放置定点开启双碟30分钟，控制杂菌菌落≤1个/碟。每天用前紫外光消毒一小时，每三个月调换消毒剂（1/600洁尔灭、75%酒精）。
4.1.3 孢子斜面：
取生产用之孢子沙土管或孢子冷冻管在无菌室内，用操作棒勺取适量孢子接种于斜面培养基上，尽量将孢子涂开使长单个集落，然后于27±1℃恒温室内培养6—7天，该生长成之孢子斜面称为原斜面，仅作孢子传代使用，不能制备母瓶，液氮冷冻孢子接出原斜面。根据质量情况可酌量考虑制作母瓶，有效使用期在2—4℃冷藏中不超过10天。
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