微生物鉴定的生理生化反应

各种细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。用生物化学方法测定这些代谢产物，可用来区别和鉴定细菌的种类。利用生物化学方法来鉴别不同细菌，称为细菌的生物化学试验或称生化反应。生物化学试验的方法很多，主要有以下几类。 一、碳水化合物的代谢试验 1．糖（醇、苷）类发酵试验

（1）原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。 (2)方法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）类。所使用的糖（醇、苷）类有很多种，根据不同需要可选择单糖、多糖或低聚糖、多元醇和环醇等，见表6-4-1。将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35℃孵育箱内孵育数小时到两周（视方法及菌种而定）后，观察结果。若用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥。

(3)结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。不分解糖则无变化。

(4)应用：糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不同细菌可发酵 不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此试验鉴别细菌。

表6-4-1 常用于细菌糖发酵试验的糖、醇类

单糖 四碳糖：赤藓糖 , 五碳糖：核糖 核酮糖 木糖 阿拉伯糖, 六碳糖：葡萄糖 果糖 半乳糖 甘露糖

双糖 蔗糖（葡萄糖＋果糖） 乳糖（葡萄糖＋半乳糖） 麦芽糖（两分子葡萄糖） 三糖 棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖） 多糖 菊糖（多分子果糖） 淀粉

醇类 侧金盏花醇 卫茅醇 甘露醇 山梨醇 非糖类 肌醇

2．葡萄糖代谢类型鉴别试验

(1)原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。本试验又称氧化发酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）试验，可用于区别细菌的代谢类型。

(2)方法：挑取少许纯培养物（不要从选择性平板中挑取）接种2支HL培养管中，在其中一管加入高度至少为0.5cm的无菌液体石蜡以隔绝空气（作为密封管），另一管不加（作为开放管）。置35℃孵箱孵育48h以上。。

(3)结果： 两管培养基均不产酸（颜色不变）为阴性；两管都产酸（变黄）为发酵型；加液体石蜡管不产酸，不加液体石蜡管产酸为氧化型。

(4)应用：主要用于肠杆菌科与其它非发酵菌的鉴别。肠杆菌科、弧菌科细菌为发酵型，非发酵菌为氧化型或产碱型。也可用于鉴别葡萄球菌（发酵型）与微球菌（氧化型）。 3．甲基红（MR）试验

(1)原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步被分解为甲酸、乙酸和琥珀酸等，使培养基pH下降至4.5以下时，加入甲基红指示剂呈红色。如细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其它物质（如醇、醛、酮、气体和水），培养基pH在 5.4以上，加入甲基红指示剂呈桔黄色。

(2)方法：将待试菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35℃孵育48h~96h后，于5ml培养基中滴加5~6滴甲基红指示剂，立即观察结果。

(3)结果判定：呈现红色者为阳性，桔黄色为阴性，桔红色为弱阳性。

(4)应用：常用于肠杆菌科内某些种属的鉴别，如大肠埃希菌和产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。肠杆菌属和哈夫尼亚菌属为阴性，而沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属和变形杆菌属等为阳性。

4．β－半乳糖苷酶试验（ONPG试验）

(1)原理：乳糖发酵过程中需要乳糖通透酶和β－半乳糖苷酶才能快速分解。有些细菌只有半乳糖苷酶，因而只能迟缓发酵乳糖，所有乳糖快速发酵和迟缓发酵的细菌均可快速水解邻硝基酚-β-D-半乳糖苷（O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG）而生成黄色的邻硝基酚。用于枸橼酸菌属、亚利桑那菌属与沙门菌属的鉴别。

(2)方法：将待试菌接种于ONPG肉汤中，35℃水浴或孵箱孵育18~24h，观察结果。 (3)结果：呈现亮黄色为阳性，无色为阴性。

(4)应用：可用于迟缓发酵乳糖细菌的快速鉴定，本法对于迅速及迟缓分解乳糖的细菌均可短时间内呈现阳性。埃希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、哈夫尼亚菌属、沙雷菌属和肠杆菌属等均为试验阳性，而沙门菌属、变形杆菌属和普罗威登斯菌属等为阴性。

5．VP试验

(1)原理：测定细菌产生乙酰甲基甲醇的能力。某些细菌如产气肠杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧形成乙酰甲基甲醇。在碱性条件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，进而与培养基中的精氨酸等含胍基的物质结合形成红色化合物。即V-P试验阳性。 (2)方法：将待检菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35℃孵育24~48h，加入50g/Lα－萘酚（95％乙醇溶液）0.6ml，轻轻振摇试管，然后加0.2ml 400g/L KOH，轻轻振摇试管30s至1min，然后静置观察结果。

(3)结果：红色者为阳性，黄色或类似铜色为阴性。

(4)应用：主要用于大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别。本试验常与MR试验一起使用，一般情况下，前者为阳性的细菌，后者常为阴性，反之亦然。但肠杆菌科细菌不一定都这样规律，如蜂房哈夫尼亚菌和奇异变形杆菌的VP试验和MR试验常同为阳性。 6．胆汁七叶苷水解试验

（1）原理：在10%~40％胆汁存在下，测定细菌水解七叶苷的能力。七叶苷被细菌分解生成的七叶素，七叶素与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子发生反应形成黑色化合物。 (2)方法：将被检菌接种于胆汁七叶苷培养基中，35℃孵育18~24h后，观察结果。 (3)结果：培养基完全变黑为阳性，不变黑为阴性。

(4)应用：主要用于鉴别D群链球菌与其它链球菌的区别，以及肠杆菌科的某些种、某些厌氧菌（如脆弱拟杆菌等）的初步鉴别。D群链球菌本试验为阳性。 7．淀粉水解试验

(1)原理：产生淀粉酶的细菌能将淀粉水解为糖类，在培养基上滴加碘液时，可在菌落周围

出现透明区。

(2)方法：将被检菌划线接种于淀粉琼脂平板或试管中，35℃孵育18~24h，加入革兰碘液数滴，立即观察结果。

(3)结果：阳性反应，菌落周围有无色透明区，其它地方蓝色；阴性反应，培养基全部为蓝色。

(4)应用：用于白喉棒状杆菌生物型的分型，重型淀粉水解试验阳性，轻、中型阴性；芽胞杆菌属菌种和厌氧菌某些种的鉴定。 8．甘油复红试验

(1)原理：甘油可被细菌分解生成丙酮酸，丙酮酸脱去羧基为乙醛，乙醛与无色的复红生成醌式化合物，呈深紫红色。

(2)方法：取被检菌接种于甘油复红肉汤培养基中，于35℃孵育，观察2~8d。应同时做阴性对照。

(3)结果：紫红色为阳性，与对照管颜色相同为阴性。

(4)应用：主要用于沙门菌属内各菌种间的鉴别。伤寒沙门菌、甲（丙）型副伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、孔道夫沙门菌和仙台沙门菌本试验为阴性，乙型副伤寒沙门菌结果不定，其它不常见沙门菌多数为阳性。 9．葡萄糖酸氧化试验

(1)原理：某些细菌可氧化葡萄糖酸钾，生成α-酮基葡萄糖酸。α-酮基葡萄糖酸是一种还原性物质，可与班氏试剂起反应，出现棕色或砖红色的氧化亚铜沉淀。

(2)方法：将待检菌接种于葡萄糖酸盐培养基中(1ml)，置35℃孵育48h,加入班氏试剂1ml，于水浴中煮沸10min并迅速冷却，观察结果。

(3)结果：出现黄到砖红色沉淀为阳性。不变或仍为蓝色为阴性。 (4)应用：主要用于假单胞菌的鉴定和肠杆菌科菌分群。 二、氨基酸和蛋白质的代谢试验 1．硫化氢试验

(1)原理：某些细菌能分解含硫氨基酸生成硫化氢，与亚铁离子或铅离子结合形成黑色沉淀物。

(2)方法：将待检菌接种于含硫化物及亚铁离子的培养基或克氏双糖铁琼脂（KIA）中，35℃孵育18~24h，观察有无黑色沉淀出现。或用醋酸铅纸条，悬挂于KIA管中（白色滤纸，根据试管大小裁剪适当，在热的50g/L醋酸铅饱和水溶液中浸泡，然后于50~60℃烘干，121℃15min高压灭菌备用）。醋酸铅是最敏感的方法。 (3)结果：有黑色沉淀物为阳性。

(4)应用：主要用于鉴别肠杆菌科细菌，如沙门菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、爱德华菌属等为阳性，其它菌属大多为阴性。但沙门菌属中亦有部分硫化氢阴性菌株，如甲型副伤寒、仙台、猪霍乱沙门菌等。 2．明胶液化试验

(1)原理：细菌分泌的胞外蛋白水解酶（明胶酶）能分解明胶，使明胶失去凝固能力而液化。 (2)方法：将待检菌接种于明胶培养基中，35℃孵育24h到7d或更长时间，每24h取出放入4℃冰箱约2h后，观察有无凝固。

(3)结果：如无凝固，则表示明胶已被水解，液化试验阳性。如凝固，则继续培养。

(3)应用：奇异变形杆菌、普通变形杆菌、沙雷菌属和阴沟肠杆菌等到能液化明胶，肠杆菌科中的其它细菌很少液化明胶。有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也能液化明胶。另外，许多假单胞菌也能产生明胶酶而使明胶液化。 3．吲哚试验（靛基质试验）

(1)原理：某些细菌有色氨酸酶，能分解色氨酸产生吲哚，吲哚与对二甲氨基苯甲醛形成红色的玫瑰吲哚。

(2)方法：将待检菌接种于富含色氨酸的蛋白胨水培养基中，35℃孵育24~48h，加入靛基质试剂，观察结果。

(3)结果：红色为阳性，无色为阴性。

(4)应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定，如大肠埃希菌与产气肠杆菌，肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌等的鉴别。 4．苯丙氨酸脱氨酶试验

(1)原理：测定细菌是否产生苯丙氨酸脱氨酶。细菌产生的苯丙氨酸脱氨酶使苯丙氨酸脱氨后生成苯丙酮酸，加入三氯化铁试剂后产生绿色反应。若延长时间，会引起退色。

(2)方法：将待检菌大量接种入苯丙氨酸培养基中，35℃孵育18~24h，滴加100g/L三氯化铁试剂4~5滴，立即观察菌落生长处有无绿色出现。 (3)结果：有绿色出现为阳性。

(4)应用：变形杆菌属、普罗威登菌属、摩根菌属均为阳性，肠杆菌科其它细菌均为阴性。 5．氨基酸脱羧酶试验

(1)原理：某些细菌可产生氨基酸脱羧酶使氨基酸脱羧生成胺和二氧化碳。由于胺的生成使培养基变为碱性，可用指示剂指示出来。

(2)方法：将待检菌分别接种于1支氨基酸（赖氨酸，鸟氨酸或精氨酸）脱羧酶试验管和1支氨基酸脱羧酶对照管（无氨基酸），各覆盖至少0.5cm高度的无菌石蜡油，35℃孵育1~4d，观察结果。

(3)结果：若为溴甲酚紫指示剂，则试验管紫色为阳性，黄色为阴性，对照管应为黄色。 (4)应用：主要用于某些细菌种间的鉴别，如赖氨酸用于产气肠杆菌（阳性）与阴沟肠杆菌（阴性）；鸟氨酸用于阴沟肠杆菌（阳性）和克雷伯菌（阴性）；精氨酸用于阴沟肠杆菌（阳性）和产气肠杆菌（阴性）等。 6．精氨酸双水解酶试验

(1)原理：精氨酸经两次水解后,生成鸟氨酸、氨及二氧化碳。鸟氨酸又在脱羧酶的作用下生成腐胺。氨及腐胺均为碱性物质，故可使培养基变碱，用指示剂指示出来。 (1) 方法：将待检菌接种于试验培养上，置35℃孵箱孵育1~4d，观察结果。

(2) 结果：溴甲酚紫指示剂呈紫色为阳性，酚红指示剂呈红色为阳性。黄色为阴性。 (3) 应用：主要用于肠杆菌科及假单胞菌属的鉴定。 7．尿素酶试验

(1)原理：某些细菌能产生尿素酶，分解尿素产生大量的氨，使培养基变碱。 (2)方法：将待检菌接种于含有尿素的培养基中，35℃孵育18~24h，观察结果。 (3)结果：红色为阳性，不变为阴性。

(4)应用：主要用于肠杆菌科变形杆菌属、普罗威登菌属、克雷伯菌属及假单胞菌属的鉴定。

8．霍乱红试验

(1)原理：霍乱弧菌分解色氨酸生成吲哚，并能使硝酸盐还原为亚硝酸盐，当加入硫酸后生成亚硝酸吲哚，呈红色反应。

(2)方法：将待检菌接种于蛋白胨水中，置35℃孵育24h，加入浓硫酸数滴，观察结果。 (3)结果：呈红色者为阳性。

(4)应用：霍乱弧菌呈阳性反应，但本试验并非霍乱弧菌所特有。凡能产生吲哚并还原硝酸盐为亚硝酸盐的细菌，均可呈现阳性反应。 三、碳源和氮源利用试验