果酒酵母实验报告 下载本文

.

果酒酵母的分离纯化及选育

果酒是利用新鲜水果为原料,在保存水果原有营养成分的情况下,利用自然发酵或人工添加酵母菌来分解糖分而制造出的具有保健、营养型酒。果酒富含多种氨基酸、维生素及矿物质等营养成分,还含有丰富的生理活性物质,经常适量饮用具有一定的保健作用。酵母品种是酿造果酒的关键因素之一,酵母性状的好坏直接影响到所酿果酒的口感和风味,决定果酒品质的优劣。果酒酵母包括醇酿酒酵母和非酿酒酵母,前者的应用提高了果酒酿造的生产效率,后者的应用则对果酒的总体风味产生积极的影响。野生型果酒酵母经分离纯化后,结合诱变、杂

.

.

交、原生质体融合、基因工程及其他育种技术,其酿造性能显著提高,酿造的果酒品质明显改善,因此果酒酵母的选育研究得到了重点关注。本实验选用葡萄为原料,分离纯化了3株酵母菌,并对其筛选使其适合果酒酿造。 一、实验目的

1、学习掌握果酒酵母分离纯化的方法;

2、对分离纯化得到的酵母菌进行筛选使其适合果酒酿造。 二、实验原理

酿酒酵母细胞透明,呈圆形或椭圆形,形体比较大,一般为7×12μm,含有转化酶能将葡萄汁中的糖转化成乙醇、二氧化碳和其它代产物。优良纯种酵母应具备下列性能:1、除酿酒水果本身的果香外,酵母也应产生良好的果香与酒香。2、生长速度快,有较高的发酵能力,能将糖分全部发酵完。3、具有较高的抗S02能力,有较好的凝集力和较快的沉降速度。4、培养基成分简单,来源广泛,价格低廉,对温度,pH,离子强度,溶氧等环境因素不敏感。5、能在低温或果酒适宜温度下发酵,以保持果香和新鲜清爽的口味。

由此可见,酵母的品质对果酒的产量和质量影响很大。要获得优良的酿酒酵母,必须对其进行分离选育。果酒酵母的筛选应从相应的果品及其种植环境中采样分离,如成熟果实的表皮、自然腐烂发酵的果肉或果汁和果园的土壤等相关场所。根据实践经验,在果汁和自然发酵的果酒醪液中检出率较高,因为它们的基质环境与酿酒环境很相似。为使我们需要的酵母易于检出,应对采集的样品进行富集培养,通过设置较高的酒精浓度、添加SO2、调整pH 等手段抑制不需要的微生物的生长,使希望检出的微生物得到增殖。酵母检出后,应对其的发酵性能进行考察,包括酵母的一系列生理生化特性和风味物质形成的能力等,这些可通

.

.

过作生理生化实验和三角瓶小型发酵实验分析和测定。 三、实验仪器与材料

富集培养基:乳酸马铃薯葡萄糖培养液:马铃薯200g,葡萄糖20g,乳酸20g,蒸馏水1000ml(先将马铃薯去皮、切片,称200g,并加蒸馏水1000ml,煮沸半小时,用纱布过滤,补足蒸馏水量至1000ml,制成20%的马铃薯汁,在20%的马铃薯汁中加入乳酸,煮沸融化,加入葡萄糖,补足水分并在121摄氏度条件下,高温灭菌30分钟)

酿酒酵母培养基:马铃薯葡萄糖琼脂培养基:马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂20g,蒸馏水1000ml,制法同上。

器具:15个培养皿、12支试管、4个100ml锥形瓶、3个250ml烧杯、30个试管、30个杜氏管、1个试管架、7个三角瓶,无菌滴管,接种环,酒精灯,玻璃涂棒,冰箱,高温灭菌锅,水浴锅,显微镜,血球计数板,恒温培养箱、恒温摇床。

四、实验容及步骤 1、酵母的分离与纯化

1.1接种:取成熟的苹果的小块果皮直接接入250ml锥形瓶含有150ml的乳酸马铃薯葡萄糖培养液中,需要三组,置于28摄氏度恒温摇床中,转速为120,震荡培养48h;将苹果果皮研磨直接接入马铃薯葡萄糖琼脂培养基中,需要三组,置于29摄氏度恒温培养箱中,培养48h;

1.2培养:用无菌吸管吸取上述培养后培养液1ml,置于9ml的无菌水中,稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5;

1.3分离、纯化:马铃薯葡萄糖培养基溶化后制成平板,用1ml的无菌吸管,分

.

.

别吸取10、10、10置于培养基表面,用无菌的玻璃涂棒迅速涂抹均匀,培养基做好标记,放于恒温培养箱培养大约两天,培养基倒置,菌落长出后,观察其菌落并用显微镜查菌体数。

一般一个单独的菌落可视为一个细胞发育而来,是纯培养,如果结构复杂未得到纯培养,可进行再次分离培养知道纯化为止,步骤如下:

A.将融化了的马铃薯葡萄糖琼脂培养基倒入无菌培养皿中,每皿大约15ml,冷凝成平面,记上标记; B.用平板划线法接种

(一)右手持接种环,经火焰灭菌,待凉后,挑取菌体培养物少许。

(二)左手斜持琼脂平板,于火焰近处将菌涂于琼脂平板上端,来回划线,涂成薄膜(约占平板总表面积的十分之一),划线时接种环与平板表面成30~40o角,轻轻接触,以腕力在平板表面行轻快地滑移动作,接种环不应划破培养基表面。 (三)烧灼接种环,杀灭环上残留细菌,待冷(是否冷却,可先在培养基边缘处试触,若琼脂溶化,表示未凉,稍等再试),从薄膜处取菌作连续平行划线,约占平板表面五分之一左右,再次烧灼接种环,等三次平行划线……以同样方法作第四次,第五次划线,将平板表面划完。

(四)划线完毕,盖上皿盖,底面向上,用标签注明菌名和组名,置恒温箱中培养,长出菌落即可。 2、酵母的筛选与保藏 2.1酵母菌种的复筛

发酵力实验:取100ml三角瓶,各加入80ml果汁,置于80摄氏度的水浴杀

.

-3-4-5

.

菌5min,冷却到30摄氏度后,按每升接种30ml的比例分别接入酵母种子液,在20摄氏度下发酵。发酵过程中每24小时测定1次三角瓶质量,确定菌株发酵力的强弱。

2.2酵母菌的耐受性试验

1.用配好的PDA液体培养基,将培养基分别倒入试管与三角瓶中,试管每支10ml,共300ml,三角瓶每瓶50ml、共350ml。再将三角瓶和试管在121°高温下灭菌30min。杜氏管倒置放入试管中,保证杜氏管中没有气泡。

2.采用杜氏管发酵法测定所筛选的酵母菌对乙醇(4%、6%、8%、10%、12%)、二氧化硫(40、60、80、100、120mg/l)的耐性。

按下表在试管中加入果汁。然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁,塞好棉塞,115℃ 20min灭菌。灭菌完后,待试管温度为常温后按下表加入酒精,加完后摇匀。最后在每个编号试管中接入对数期酵母1×107个,28℃静止培养。观察产气情况,选出耐酒度比较好的菌种。

将标签贴于各试管上,标10、12、14、16、18,按下表每管加入果汁量: 试管编号 95%酒精/mL 果汁/mL

培养液含酒精%

0

(v/v)

按亚硫酸含量为6% 计, 计算出60、100、120、180、240 mg/L浓度所需的量,分别加入到果汁中制成SO 2 不同浓度系列的液体培养基。

10

12

14

16

18

20

0 0 10

10 1.05 8.95

12 1.26 8.74

14 1.4 8.60

16 1.68 8.32

18 1.90 8.10

20 2.15 7.85

.