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果酒酵母的分离纯化及选育

果酒是利用新鲜水果为原料，在保存水果原有营养成分的情况下，利用自然发酵或人工添加酵母菌来分解糖分而制造出的具有保健、营养型酒。果酒富含多种氨基酸、维生素及矿物质等营养成分，还含有丰富的生理活性物质，经常适量饮用具有一定的保健作用。酵母品种是酿造果酒的关键因素之一，酵母性状的好坏直接影响到所酿果酒的口感和风味，决定果酒品质的优劣。果酒酵母包括醇酿酒酵母和非酿酒酵母，前者的应用提高了果酒酿造的生产效率，后者的应用则对果酒的总体风味产生积极的影响。野生型果酒酵母经分离纯化后，结合诱变、杂

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交、原生质体融合、基因工程及其他育种技术，其酿造性能显著提高，酿造的果酒品质明显改善，因此果酒酵母的选育研究得到了重点关注。本实验选用葡萄为原料，分离纯化了3株酵母菌，并对其筛选使其适合果酒酿造。 一、实验目的

1、学习掌握果酒酵母分离纯化的方法；

2、对分离纯化得到的酵母菌进行筛选使其适合果酒酿造。 二、实验原理

酿酒酵母细胞透明，呈圆形或椭圆形，形体比较大，一般为7×12μm，含有转化酶能将葡萄汁中的糖转化成乙醇、二氧化碳和其它代产物。优良纯种酵母应具备下列性能：1、除酿酒水果本身的果香外，酵母也应产生良好的果香与酒香。2、生长速度快，有较高的发酵能力，能将糖分全部发酵完。3、具有较高的抗S02能力，有较好的凝集力和较快的沉降速度。4、培养基成分简单，来源广泛，价格低廉，对温度，pH，离子强度，溶氧等环境因素不敏感。5、能在低温或果酒适宜温度下发酵，以保持果香和新鲜清爽的口味。

由此可见，酵母的品质对果酒的产量和质量影响很大。要获得优良的酿酒酵母，必须对其进行分离选育。果酒酵母的筛选应从相应的果品及其种植环境中采样分离，如成熟果实的表皮、自然腐烂发酵的果肉或果汁和果园的土壤等相关场所。根据实践经验，在果汁和自然发酵的果酒醪液中检出率较高，因为它们的基质环境与酿酒环境很相似。为使我们需要的酵母易于检出，应对采集的样品进行富集培养，通过设置较高的酒精浓度、添加SO2、调整pH 等手段抑制不需要的微生物的生长，使希望检出的微生物得到增殖。酵母检出后，应对其的发酵性能进行考察，包括酵母的一系列生理生化特性和风味物质形成的能力等，这些可通

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过作生理生化实验和三角瓶小型发酵实验分析和测定。 三、实验仪器与材料

富集培养基：乳酸马铃薯葡萄糖培养液：马铃薯200g，葡萄糖20g，乳酸20g，蒸馏水1000ml（先将马铃薯去皮、切片，称200g，并加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至1000ml，制成20%的马铃薯汁，在20%的马铃薯汁中加入乳酸，煮沸融化，加入葡萄糖，补足水分并在121摄氏度条件下，高温灭菌30分钟）

酿酒酵母培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，制法同上。

器具：15个培养皿、12支试管、4个100ml锥形瓶、3个250ml烧杯、30个试管、30个杜氏管、1个试管架、7个三角瓶，无菌滴管，接种环，酒精灯，玻璃涂棒，冰箱，高温灭菌锅，水浴锅，显微镜，血球计数板，恒温培养箱、恒温摇床。

四、实验容及步骤 1、酵母的分离与纯化

1.1接种：取成熟的苹果的小块果皮直接接入250ml锥形瓶含有150ml的乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，需要三组，置于28摄氏度恒温摇床中，转速为120，震荡培养48h；将苹果果皮研磨直接接入马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，需要三组，置于29摄氏度恒温培养箱中，培养48h；

1.2培养：用无菌吸管吸取上述培养后培养液1ml，置于9ml的无菌水中，稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5；

1.3分离、纯化：马铃薯葡萄糖培养基溶化后制成平板，用1ml的无菌吸管，分

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别吸取10、10、10置于培养基表面，用无菌的玻璃涂棒迅速涂抹均匀，培养基做好标记，放于恒温培养箱培养大约两天，培养基倒置，菌落长出后，观察其菌落并用显微镜查菌体数。

一般一个单独的菌落可视为一个细胞发育而来，是纯培养，如果结构复杂未得到纯培养，可进行再次分离培养知道纯化为止，步骤如下：

A.将融化了的马铃薯葡萄糖琼脂培养基倒入无菌培养皿中，每皿大约15ml，冷凝成平面，记上标记； B.用平板划线法接种

（一）右手持接种环，经火焰灭菌，待凉后，挑取菌体培养物少许。

（二）左手斜持琼脂平板，于火焰近处将菌涂于琼脂平板上端，来回划线，涂成薄膜（约占平板总表面积的十分之一），划线时接种环与平板表面成30~40o角，轻轻接触，以腕力在平板表面行轻快地滑移动作，接种环不应划破培养基表面。 （三）烧灼接种环，杀灭环上残留细菌，待冷（是否冷却，可先在培养基边缘处试触，若琼脂溶化，表示未凉，稍等再试），从薄膜处取菌作连续平行划线，约占平板表面五分之一左右，再次烧灼接种环，等三次平行划线……以同样方法作第四次，第五次划线，将平板表面划完。

（四）划线完毕，盖上皿盖，底面向上，用标签注明菌名和组名，置恒温箱中培养，长出菌落即可。 2、酵母的筛选与保藏 2.1酵母菌种的复筛

发酵力实验：取100ml三角瓶，各加入80ml果汁，置于80摄氏度的水浴杀

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-3-4-5

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菌5min，冷却到30摄氏度后，按每升接种30ml的比例分别接入酵母种子液，在20摄氏度下发酵。发酵过程中每24小时测定1次三角瓶质量，确定菌株发酵力的强弱。

2.2酵母菌的耐受性试验

1.用配好的PDA液体培养基，将培养基分别倒入试管与三角瓶中，试管每支10ml，共300ml，三角瓶每瓶50ml、共350ml。再将三角瓶和试管在121°高温下灭菌30min。杜氏管倒置放入试管中，保证杜氏管中没有气泡。

2.采用杜氏管发酵法测定所筛选的酵母菌对乙醇（4%、6%、8%、10%、12%）、二氧化硫（40、60、80、100、120mg/l）的耐性。

按下表在试管中加入果汁。然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁，塞好棉塞，115℃ 20min灭菌。灭菌完后，待试管温度为常温后按下表加入酒精，加完后摇匀。最后在每个编号试管中接入对数期酵母1×107个，28℃静止培养。观察产气情况，选出耐酒度比较好的菌种。

将标签贴于各试管上，标10、12、14、16、18，按下表每管加入果汁量： 试管编号 95%酒精/mL 果汁/mL

培养液含酒精%

0

（v/v）

按亚硫酸含量为6% 计， 计算出60、100、120、180、240 mg/L浓度所需的量，分别加入到果汁中制成SO 2 不同浓度系列的液体培养基。

10

12

14

16

18

20

0 0 10

10 1.05 8.95

12 1.26 8.74

14 1.4 8.60

16 1.68 8.32

18 1.90 8.10

20 2.15 7.85

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