镜下每格所代表的实际长度。

将待测微生物制成水浸片或染色涂片置载物台上，调焦找到微生物后用目镜测微尺测量其宽几格，长几格,然后乘上相应放大倍数下的校正值。

一般测10个微生物，然后以平均值表示。

若是酵母、细菌等单细胞微生物,通常测其宽和长，然后以平均宽′平均长表示,单位为μm。 2、以测苏云金杆菌工业菌粉中的活菌数为例，试述稀释平板计数的基本方法。

（1）.测数前先准备好测数用的1ml无菌吸管,9cm无菌平皿，9ml试管无菌水和牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。

(2).称取10克工业菌粉加入90ml无菌水中置摇床上或用手振荡20-30分钟，让菌体分散。 将上述振荡过的菌液按无菌操作法进行十倍稀释直到10-8。

取9cm无菌平板皿9套用记号笔在平皿底编号，10-8编3套，10-7编3套，10-6编3套。 用1支1ml的无菌吸管，取1ml10-8的稀释菌液放入编号10-8的平皿中，如此将三个重复做完。同法取10-7稀释菌液放入三个编号为10-7平皿中。同法取10-6稀释菌液放入三个编号为10-6平皿中.(均要按无菌操作法做)。

将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基熔化冷至45-50℃后，在酒精灯火焰边按无菌操作法倒入上述9套平皿中，每个加入量大约15-20ml，边加边摇动平皿,，使培养基与菌液充分混匀。

待培养基凝固后,将平板倒过来，置28-30℃下培养48小时后计数。 3、试述划线分离的操作方法。

1. 取9ml无菌平皿一套在火焰旁按无菌操作法倒人15-20ml营养琼脂，让其冷凝成平板。

2.左手拿上述平板,右手拿接种环在火焰上灭菌后沾取原始分离物在平板上平行划线三条。 3.将接种环在火焰上灭菌,左手平板转动大约70度，用灭菌接种环通过第一次划线的地方作二次划线，亦划三条。

同上法再作第三次,，第四次划线。

盖上平板盖，将平板倒过来置28-30℃下培养2-4天后观察结果。划的好应在第四次划线处出现单个菌落。

注:本答案也可画图说明。

46

4、如何检查细菌的运动性? 检查细菌的运动性有两种方法: 镜检法

将待检样品制成菌悬液,滴一点菌液于一盖玻片上，取一凹窝载玻片，将凹窝对准菌悬液盖在盖玻片上，然后将盖玻片和载玻片一起翻转，让菌悬液在凹窝上的盖玻片下。然后在显微镜下观察，观察应找悬液的边缘，因细菌为了更多地接触空气，总向水滴的边缘运动。观察时要注意将细菌的运动与分子的布朗运动区别开。

半固体穿刺法

将待检细菌穿刺接种在半固体试管培养基中,若细菌仅沿穿刺线生长,说明细菌不运动。若细菌沿穿刺线向周围扩散生长,说明细菌有运动性。

5、简述配制培养基的基本原则:

培养基是人工配制的供不同微生物生长繁殖，或用于积累代谢产物的营养基质。所以配制培养基时应注意以下原则：

1. 根据微生物的不同选用不同的培养基，以满足微生物对营养物的需要。如自养型微生物所要求营养较简单，而异养型微生物营养要求较复杂。培养细菌，放线菌，真菌等各有不同的培养基。

2. 注意各种营养物质的浓度与配比。微生物生长所需要的营养物质往往在适当时才生长良好。浓度大往往会抑制微生物的生长。如糖类，各种重金属盐类如果浓度太高，也会影响微生物的生长。同时各种营养物质的浓度比也应注意，特别是C/N比。

3. 注意将培养基的pH值控制在一定范围内。为了防止因微生物生长繁殖或积累代谢产物后影响培养基pH值，常在其中加入磷酸盐，碳酸盐，以维持培养基pH值的相对恒定。

同时还应考虑培养基的氧化还原电位及原材料的经济、易购和来源广泛的原则。 6、试述配制培养基的基本过程及应该注意的问题。 配制培养基的基本过程是:

按培养基的配方称取各种药品，用量太少的药品应配制成溶液后再取一定量加入。 将各种药品加水溶解，通常是加所需水量的一半。

若配固体培养基，按2%的用量称取琼脂，用水将琼脂浸湿一下，用手挤去琼脂中过多的水分，加入2的溶液中。

47

加热至琼脂全部溶解，并补足所需的全部水量。 用1molNaOH和1molHCL调节pH至要求值。

用分装器将培养基分装入试管或三角瓶中，塞上棉塞并包扎，灭菌后备用。 注意事项:

配制过程中，在加热熔化琼脂时，要不断搅拌，以防糊底。

分装时不要让培养基沾染试管口或瓶口，以防培养过程中容易污染杂菌。 7、试述显微计数的基本方法。

显微计数通常用来测微生物单细胞的数量，大一点的细胞如酵母菌用血球计数板，小一点的细胞如细菌用细菌计数板。该测数方法不能区别死活细胞，测出的是微生物总的细胞数量。 血球计数板和细菌计数板构造相似，计数区的面积都是1mm2，两者的差别在于血球计数板的深度为0.1mm。细菌计数板的深度为0.02mm。无论是血球计数板还是细菌计数板计数区都划为25个大方格，每个大方格又划为16个小格。所以每小格的体积为1/4000mm3或1/20000mm3。 计数时,先在显微镜下找到计数区，然后将菌液稀释到适当浓度，取少量菌液滴在计数区上盖上特制盖玻片，亦可先盖盖玻片。然后用吸管将菌液从计数板上的沟里加入。靠菌液的表面张力充满计数区。

计数时采取五点取样法数数，即四角各取一个大方格，再在中央取一个大方格。计数时大方格四周压线的细胞只数两边，以防增加数量。

将5个大方格的菌数加起来除以80得出每个小格的菌数，再乘以4000即为1mm3的菌数，再乘上1000即为1ml的菌数，乘上稀释倍数即为样品含菌数。

8、标本片上的某一物象，第一次看到后如何再次找到它?

要做到这一点，首先取决于显微镜的好坏，若显微镜上的推动器带有纵横标尺，很容易做到这一点。首先记住标本片放到推动器上的方向，然后记下观察某一物体时推动器上的纵横标尺的数字。如纵3，横4。

当标本片拿下来后，若要重复观察原来的物象，只要按原方向将标本片荚在推动器上，将推动器推动到第一次观察该物体的纵，横标尺数字纵3，横4，即可看到第一次观察过的物体。

9、试述在光学显微镜下所看到的Anabaenaazotica的主要特征。 Anabaenaazotica的主要特征是:

菌体为丝状体，营养细胞为绿色，藻丝不扭曲。

48

该菌有异型胞,异型胞间生，无色透明，两端有极点。 厚壁孢子无色、大、两端无极点。

10革兰氏染色反应的成败关键是什么?为什么革兰氏染色有十分重要的理论与实践意义? 因通过革兰氏染色，可把几乎所有的细菌都分成G＋和G－菌两大类细菌，在细胞结构、成分、形态、生理、生化、遗传、免疫、生态和药物敏感性等方面都呈现出明显的差异。因此，任何细菌只要通过革兰氏染色，即可提供不少重要的生物学特性方面的信息。

革兰氏染色反应的成败关键是: 菌龄:12-24小时的纯培养物。

革兰氏染色操作时，要严格控制酒精脱色时间，菌液涂布均匀而薄。 培养基的组成。

11、如何从土壤中分离得到一个微生物的纯培养体?

首先要根据分离对象选择适宜的培养基。若要分离真菌应选用马丁-孟加拉红选择培养基；若要分离细菌应选用牛肉膏蛋白胨培养基；若要分离放线菌应选用高氏培养基。

土样采回来后，用常规的十倍稀释分离法进行稀释分离，若分离细菌，一般稀至10-8,若分离放线菌,一般稀至10-6；若分离真菌，一般稀至10-4。取最后三个稀释度倒平板获得单个菌落。 将平板上出现的单菌落转接斜面培养，同时镜检菌体的纯度，若不纯，应将培养的单菌落斜面再次进行稀释分离。倒平板获得单菌落，转接斜面培养，同时镜检菌体的纯度。反复几次直到得到菌体单一的单菌落方可认为是某一微生物的纯培养体。

12、察氏培养基的组成为:蔗糖:30克,磷酸氢二钾:1.0克,硝酸钠:2克,硫酸镁0.5克,氯化钾:0.5克,硫酸亚铁:0.01克,蒸馏水:1000ml.试述:

该培养基的C源,N源各是什么物质。 除C源和N源外的其它物质起什么作用: 该培养基为什么不加生长因子?

该培养基的C源物质是蔗糖，N源物质是硝酸钠。

1. 磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁为该培养基提供矿质营养。蒸馏水提供水分。

2. 该培养基培养的微生物在培养基上能合成自身所需的全部生长因子，故无需添加生长因素,该培养基所培养的微生物为野生型。.

49

50