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23. 化学法测序法的基本原理。
碱基通过特定化学试剂修饰后，哌啶甲酸使该位置的磷酸二酯键断裂。
G反应：硫酸二甲酯使G上的N7甲基化；A ＋ G反应：甲酸使A和G嘌呤环上的N质子化；C ＋ T反应：肼使T和C的嘧啶环断裂后重新环化成五元环；C反应：盐存在的条件下，肼只与C反应；
凝胶电泳将DNA链按长短分开；根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列。适用性：测定短DNA片段和某些被修饰的DNA。
24. Sanger测序法的基本原理。
酶法（Sanger法、双脱氧法、末端终止法）。利用双脱氧核苷酸2’，3’-ddNTP来终止DNA的聚合反应。样品一链为模板，引物5’端标记。在4只试管中分别加入适当的引物、模板、4中dNTP、DNA聚合酶，再分别加入一种ddNTP。与模板结合引物在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应。当ddNTP参入时，由于它在3’位置没有羟基。故不与下一个dNTP结合从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只管中的反应物，由于每一反应管中只加入了ddNTP，则该管中各种长度的DNA都终止于该碱基，且电泳中该泳道不同带DNA3’端为同一种ddNTP。根据泳道中DNA带位置读出与模板链互补的新链系列。
25. 酵母双杂交技术的基本原理
将BD与已知蛋白E融合产生的BD-E称为诱饵（Bait），将AD与末知蛋白F融合产生的AD-F称为猎物（Prey），当诱饵钓到猎物时（E和F间有相互作用），转录激活因子就能激活目标基因（报告基因）的转录与表达
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26. 核酸杂交中，探针标记的方法有哪些？ 1) 缺口平移法：标记dNTP 2) 随机引物法：标记dNTP
3) 末端标记法：碱性磷酸酶和多核苷酸激酶5’标记；末端转移酶3’标记 4) PCR法：标记dNTP
基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达 名词解释：
1、SD序列：mRNA中的核糖体结合位点，位于翻译起始位点上游，负责翻译的起始 2、表达载体：在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能够表达的载体
3、融合表达：动物或者是植物的细胞经过某种培养经过酶的作用使其细胞相融合构成的新细胞
4、inclusion body：包含体，蛋白质在大肠杆菌中大量表达时，在胞内聚集形成不可溶的、没有生物活性的固体颗粒。 5、T7启动子：
A.强大的 T7 启动子完全专一受控于 T7 RNA 聚合酶，
B.T7 RNA 聚合酶合成 mRNA 的速度比大肠杆菌RNA 聚合酶的快 5 倍
C.由于大肠杆菌本身不含 T7 RNA 聚合酶 ，需要将外源的 T7 RNA 聚合酶引入宿主菌（采用DE3溶源菌，T7RNA聚合酶置于LacUV5启动子控制下，IPTG间接诱导）。 6、 AOX1：编码乙醇氧化酶的基因
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问题：
1、表达载体有哪些特点？
（1）、具有强的启动子，如T7、SP6、tac、λ的PL等； (2)、启动子和ATG之间具有核糖体结合位点（SD序列）； (3)、具有强的转录终止序列。
2、谈谈pET表达载体系统表达目的蛋白的优点。
3、蛋白质分泌表达的优点及影响因素？
蛋白质分泌表达的优点：
1. 由于周质中蛋白质种类比较少，因此目标蛋白质的纯化就比较简单 2. 蛋白质酶解的程度不甚严重
3. 促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用（氧化环境）
4. 蛋白质的N-末端结构真实正确折叠的蛋白质，在转运过程中，在体内对信号肽进行切割
影响分泌表达的因素： （1）信号肽存在与否及类型； （2）启动子强弱；诱导剂浓度；
（3）宿主菌的类型；培养条件（温度、培养基） 4、原核表达系统和真核表达系统相比，各自的优缺点是什么？ 原核表达系统的优点：
（1）产量高、表达高效；
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（2）操作简单（可调控表达、方便纯化）； （3）可大规模发酵生产； （4）成本低。 原核表达系统的缺点：
（1）缺乏真核中的修饰系统，产物有时缺乏活性。 （2）表达产物易形成包含体
真核表达系统的优点：书78页（甲醇酵母表达系统的优点） 易培养、繁殖快、便于基因操作 真核表达系统的缺点： （1） 缺乏强有力的启动子 （2） 分泌效率差 （3） 表达质粒易丢失
5、原核表达中产生包含体的原因及解决措施有哪些？ 产生包含体的原因：
（1）原核细胞缺乏真核细胞的修饰系统；
（2）缺乏折叠所需的酶和辅助因子，无法正确折叠； （3）合成速度过快，产量太高； （4）蛋白质类型；
（5）培养条件（温度及培养基） 解决措施：
（1）降低培养温度；诱导物浓度；
（2）培养基中加入添加剂；培养基组分、pH等。
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6、酵母菌表达外源蛋白的优点。 （1）遗传背景清楚
(2)属真核模式生物，具备蛋白质翻译后加工系统 （3）可发酵生产
（4）不产生内毒素，属安全的表达系统 7、甲醇酵母表达系统的基本构成及特点 基本构成：
甲醇酵母表达载体为整合型质粒，整合位点一般位于HIS4(组氨酸脱氢酶基因)区或AOX1(乙醇氧化酶)区。载体上含有5’AOX1启动子、多克隆位点、3’AOX1终止子，以HIS4基因作为互补选择标记。 特点：
8、自选一种新型的有药用价值的细胞因子，提出基因克隆、蛋白质表达与纯化、生物活性测定的实验研究方案。 书80-83页
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