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刺激植物响应蛋白基因及酵母转化

作者：遇文婧 刘志华 王志英 古丽吉米拉米吉提 黄颖 刁桂萍 来源：《安徽农业科学》2014年第19期

的载体构建

（1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨150040；2.黑龙江省森林保护研究所，黑龙江哈尔滨 150040）

基因的真核表达载体，筛选多拷贝酵母转化）ACCC30153的cDNA为模板进行PCR

转入毕赤酵母（

）GS115中，并用不同中终浓

摘要 ［目的］构建刺激植物响应蛋白子。［方法］以深绿木霉（获得体，并将

基因片段，并将目的片段插入表达载体pPIC9K的相应位置，获得重组表达载

度的遗传霉素G418筛选多拷贝重组酵母菌株。［结果］对重组载体进行PCR及双酶切检测为阳性；在含有终浓度为2 mg/ml遗传霉素G418的YPD平板上筛选得到7株多拷贝的转化子

，经PCR鉴定1株转化子呈阳性。［结论］

基因的载体构建及多拷贝酵

母转化子筛选为以后大量分离纯化Epl1蛋白并研究其功能奠定基础。

关键词 深绿木霉ACCC30153；刺激植物响应蛋白；毕赤酵母

文献标识码 A文章编号 0517-6611（2014）19-06163-03

中图分类号

Abstract ［Objective］ To construct eukaryon expression vector of the eliciting plant response

en multicopy yeast transformant. ［Method］ Based on the cDNA

The recombina

transformants was screened by Geneticin 418 with different final concentration. ［Result］ PCR and

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n multicopy yeast

transformants were obtained on the YPD medium containing with final concentration of 2 mg/ml, and one strain was positive by PCR detection. ［Conclusion］ The vector construction of Epl1 gene and screening of high expressing yeast transform

基金项目 哈尔滨市科技局青年科技创新人才项目（2013RFQXJ02）资助；中央高校基本科研业务费专项资金项目（2572014 BA08）。

作者简介 遇文婧（1984- ），女，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，研究方向：森林保护。*通讯作者，副教授，从事森林保护研究。

收稿日期

刺激植物响应蛋白Epl1（Eliciting plant response protein 1）是一种小分子分泌型半胱氨酸富含蛋白，属于

［1］和深绿木霉（

等

［3］将棘孢木霉（

家族。对来源于绿色木霉（

）刺激植物响应蛋白

［2］。王允

）的刺激植物响应蛋白Epl1研究表明，2个蛋）T4菌株的

（Epl1）基因转化到毕赤酵

白均对植物无任何毒性，还具有促进植物生长提高植物对病害的免疫作用

母（P.pastoris）中，用重组蛋白Eplt4处理大豆叶片，接种大豆灰斑病（Cercosporidium sofinum ）

后，感病区域（0.75%）明显低于未用EplT4处理的大豆叶片（5.17%）。＇等研究表明，深绿木霉（

不同碳源诱导下检测到，而且在立枯丝核菌（菌对峙培养条件下均高表达

）ATCC 74058 菌株的Epl1蛋白能在

）细胞壁诱导和立枯丝核

［4］。Freitas等对来源于绿色木霉刺激植物响应蛋白SM1

［5］。上述

研究发现，用缺失SM1基因的木霉处理感染炭疽病的玉米叶片，叶片病斑明显多于野生型木霉处理过的感病叶片，证明SM1基因能够诱导植物产生系统抗性（ISR）菌株中分离出一个刺激植物响应蛋白真核表达载体上，并用电转化方法将础。

研究都证实了刺激植物响应蛋白是木霉诱导抗性机制所需要的。笔者从深绿木霉ACCC30153

基因，将其ORF 的cDNA构建到高效毕赤酵母基因转化到毕赤酵母GS115中，通过遗传霉素筛

选获得转基因毕赤酵母菌株，以期为后续大量分离纯化Epl1蛋白并研究其功能奠定良好基

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1 材料与方法 1.1 材料

）ACCC30153菌株，由中国农业微生物保

）GS115菌株、真核表达载体菌株

1.1.1 菌株与载体。深绿木霉（藏管理中心提供；毕赤酵母（

和大肠杆菌TOP10 菌株，均由哈尔滨工业大学生物实验室提供。

1.1.2 主要试剂。内切酶Promega公司；

（G418），购自Invitrogen公司；（ 1.2 方法

，

，

及T4 DNA连接酶，购自

，购自上海生工公司；DNA Marker DL2000，购）

，购自Amresco公司。

自北京泛基诺生物技术公司；酵母基因组DNA提取试剂盒，购自天为时代公司；

1.2.1 深绿木霉列两端引入I和

和

基因高效毕赤酵母真核表达载体构建。在深绿木霉Epl1的ORF序

酶切位点，进行PCR扩增并回收目的片段。采用

重组质粒，并对

基因序列和酵母表达载体的多克隆位点设计

双酶切，将目的片段连入pPIC9K 载体，获得

重组质粒进行PCR和双酶切检测。根据并合成的引物序列如下： 上游引物Ep1y：

酶切位点）；

下游引物Ep2y：

酶切位点）。

（划线部分为

（划线为

1.2.2 毕赤酵母转化及其转化子的筛选。采用电转法将重组质粒转化到感受态酵母细胞中，涂于RDB（

赖氨酸，

亮氨酸和

山梨醇，10 g/L琼脂粉，100 ml/L 10×Dextrose，100

谷氨酸，

蛋氨酸，

异亮氨酸的氨基酸）平板，30 ℃培养。挑取单菌落摇菌，然后

酵母氮源碱，2 ml/L 500×Biotin，10 ml/L 100×50 含

分别取10 μl菌液点在含遗传霉素0、0.5、0.75、1.0、1.75和2.0 mg/ml YPD平板上培养，挑取含高浓度遗传霉素G418的YPD平板上的转化子，于BMGY培养基中30 ℃振荡培养，提取酵母基因组DNA，并进行PCR检测 2 结果与分析

基因真核表达载体的构建 对所构建的深绿木霉

［6］。

2.1 刺激植物响应蛋白

基因真核表达载体进行了PCR和双酶切验证。用载体构建引物可从转化子中扩增出

大小为400~500 bp左右的目的片段（图1），初步验证了目的基因已经于载体pPIC9K链接成

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