密度梯度离心法分离PBMC

1. 在15mL离心管中加入5mL淋巴细胞分离液Ficoll。

2. 取5mL抗凝静脉血与5mL无菌PBS按照1：1充分混匀，用移液管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，动作一定要轻，注意保持清楚的界面。外周血，PBS，淋巴细胞分离液最终体积比为1：1：1。

3. 水平离心400g×30分钟。（注意：为保证分离效果，需将离心机升降速率调至最低，即升速为1，降速为0，这样调整后，升降速会比较慢，总体离心时间约为1小时。）

4. 离心后可看见管内分为三层，上层为血浆和PBS，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图)，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。

血浆和PBS

单个核细

淋巴细胞分离液

红细胞和粒细胞

5. 去除部分上层液体（用移液管吸取，不可倾倒），余下约1mL，用移液器插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一15mL离心管中，加入5倍以上体积的PBS，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次。

6. 末次离心后，弃上清，加入红细胞裂解液，室温孵育2分钟，裂解红细胞，可根据情况适量增减时间。

7. 加入10mLPBS，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次。

8. 末次离心后，弃上清，加入含有10?S的RPMI1640，重悬细胞，计数，计算细胞活力。

胞

用本法分离PBMC，每1mL全血可分离得到1~2×106PBMC，不同人个体之间存在一定差异。活细胞百分率在95％以上。 注意：

1. 所有操作都应在无菌条件下进行。

2. 在分离前Ficoll和PBS等试剂均需在37℃恒温水浴中预热半小时以上。

3. 吸取单个核细胞时不可避免会吸到Ficoll，而Ficoll密度比细胞要大，因此步骤5中需加入足量PBS稀释，若PBS体积太小可能会导致细胞无法离心收集。 4.