锥形瓶内，于180-220r/min恒温摇床上30℃培养2-3天。

2.3.1.3 提取：取发酵液20mL，平均分配到两个离心管中，12000r/min离心10min，分别收取上清液和菌体，分别保存在冰箱中。 2.3.2 全自动发酵罐的基本了解

全班同学分为两批由老师介绍全自动发酵罐的基本构造和基本操作方法。 2.4 结果与分析

本次实验得到的上清液为黄色，菌体为淡黄色。保留，作为后续试验淀粉酶活性测定及微生物生理化反应的材料。 3、淀粉酶的活性测定 3.1 实验原理

淀粉酶包括几种催化特点不同的成员，其中α-淀粉酶随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶；β-淀粉酶每次从淀粉的非还原端切下一份子麦芽糖，又被称为糖化酶。产淀粉酶的微生物在以可溶性淀粉为底物配置的固体培养基生长，其菌落周围的培养基会由白色变成灰色且透明，形成透明圈。在一定浓度范围内，透明圈的直径d与淀粉酶活力的大小（对数值）成正比。以已知浓度的淀粉酶为对照，制作透明圈与淀粉酶活力标准曲线。从样品的透明圈直径大小可在标准曲线上求得其淀粉酶活性大小。由于本方法是直接测定方法，而且灵敏度高，不需要特殊设备，故被广泛采用。 3.2 实验器材

3.2.1 菌种：产淀粉酶微生物

3.2.2 培养基：培养基Ⅱ：培养基Ⅰ加2g/L的可溶性淀粉和2g/L的琼脂，透明圈测定使用。

3.2.3 仪器和其他用具：摇床、恒温培养箱、纸片、移液枪、镊子、淀粉酶标准品、尺子、小试管、容量瓶、离心机。 3.3 实验过程

3.3.1 取取浓度为1mg/mL，2mg/mL，3mg/mL，4mg/mL，5mg/mL，6mg/mL的淀粉标准溶液和样品，滴于纸片上，使用6个培养基，每副培养皿放置4张纸片，置于培养基的方式简单表示如下：

1 2 3 4 5 6 1 x 5 x 6 x 2 1 4 3 6 5 x 1 x 5 x 6 置放完成之后，在37℃恒温培养箱中培养18-20h。 3.3.2 透明圈直径的测定

培养完成后取出，在培养基上滴加碘液，一段时间后，测定透明圈直径（cm），结果如表3-1所示：

表3-1 标准淀粉酶溶液及样品透明圈直径（cm）记录表

1mg/mL 2mg/mL 3mg/mL 4mg/mL 5mg/mL 6mg/mL 样品 2.55 2.75 3 3.2 3.25 3.25 3.1 2.7 3 3.05 3.3 3.3 3.32 3.1 2.75 3.35 样品的透明圈直径第3组实验数据与前两组相差较大（分别为2.6cm和2.55cm），故舍去。 3.4 结果与分析 3.4.1 标准曲线

测得的透明圈直径取平均值，淀粉酶溶液浓度换算为酶活力，制得表3-2如下：

表3-2 标准淀粉酶溶液数据处理结果表

序号 1 2 3 4 5 6 透明圈直径（cm） 淀粉酶活力（U/g） 2.625 2.875 3.025 3.250 3.275 3.285 3700 7400 11100 14800 18500 22200 淀粉酶活力对数值 3.568 3.869 4.045 4.170 4.267 4.346 根据数据处理结果作标准曲线，如图1所示

图1 标准曲线

3.4.2 样品酶活力计算

实验测得样品的透明圈直径平均值为3.067cm，根据标准曲线所得线性方程y=0.916x-0.6487，计算得样品的淀粉酶活力对数值为4.056，从而得出样品的淀粉酶活力为11376.3U/g。 3.5 结论

3.5.1 绘制标准曲线得线性方程为y=0.916x-0.6487。 3.5.2 被测发酵液样品的淀粉酶活力大小为11376.3U/g。 4、淀粉酶产生菌的初步鉴定（生理生化试验） 4.1 实验原理

细菌的代谢与呼吸主要取决于酶的催化作用，各种细菌具有不同的酶系组成，因此表现在对某些含碳化合物及含氮化合物的分解利用情况不同，代谢产物也有所不同，有些微生物能分泌淀粉酶将淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖；而另一些微生物分泌脂肪酶，将脂肪水解为甘油和脂肪酸。葡萄糖进入细胞后，不同细菌经不同途径发酵葡萄糖，产生不同的代谢产物。这不但充分体现了细菌代谢类型的多样性。同时，微生物对碳氮化合物的分解利用的生理生化反应也是微生物菌种鉴定的重要依据之一。

4.1.1 糖发酵实验 糖发酵实验是最常用的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是他们在分解糖的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖并产生酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。酸的产生可用指示剂来显示，在配制糖发酵培养基时，已预先加入溴甲酚紫（pH6.8以上时呈紫色，pH5.2以下时呈黄色）。当细菌发酵糖而产酸时，会使培养液由原来的紫色变为黄色。气体的产生可由糖发酵管中倒立的德汉氏小管中有无气泡来指示。

4.1.2 V.P试验 V.P试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸，丙酮酸进行缩合、脱羧后，产生中性的乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下，被空气中的氧气氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中

精氨酸的胍基起作用生成红色化合物，此即为V.P阳性反应。当试管中加α-萘酚时可以促进反应的出现。

4.1.3 甲基红试验 甲基红试验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。在细菌代谢糖产生酸的过程时，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色（pH6.2）转变为红色（pH4.4），即甲基红反应。 4.2 实验器材

4.2.1 菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、前期实验分离得到的产淀粉酶菌株等。 4.2.2 培养基：糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖）、葡萄糖蛋白胨培养基、胰蛋白胨水培养基。

4.2.3 试剂：甲基红试剂、40％KOH、5％α-萘酚等。 4.3 实验过程 4.3.1 糖发酵实验

分别接种大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、前期分离到的未知菌于糖发酵液体培养基（葡萄糖、乳糖）中，另一支不接种，37℃培养24h后，取出观察是否有颜色变化及是否有气体产生。接种有大肠杆菌的培养液变成黄色，并且有气体产生，其他三支试管均无明显现象。如图4-1所示为葡萄糖发酵液体培养基的结果，图4-2为乳糖发酵液体培养基的结果。

图4-1 葡萄糖发酵实验结果图 图4-2 乳糖发酵实验结果图

4.3.2 V.P试验

分别接种大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、前期分离到的未知菌于葡萄糖蛋白胨培养基中，另一支不接种，37℃培养24h后，在三支菌管内加40％KOH20滴，再加等量的α-萘酚溶液，拔去硅胶塞，用力振荡后于37℃保温30min，取出观察是否出现红色。接种有枯草芽孢杆菌的培养液变成红色，其他均无明显现象。如图4-3所示为加入40％KOH和α-萘酚之前的结果。。（由于在实验过程中往接有枯草芽孢杆菌的试管中加α-萘酚时出现意外，打翻了一部分，但并没有影响到结果的观察，但之后并没有拍照，因此没有实验结果图。）

图4-3 V.P试验加入试剂之前的结果图

4.3.3 甲基红试验

分别接种大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、前期分离到的未知菌于葡萄糖蛋白胨培养基中，另一支不接种，37℃培养24h后，在培养液中加入M.R试剂2滴，观