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表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色测定吸光度，从标准曲线上查出(或用同归方程计 算）脯氨酸的含量。 二、材料、仪器设备及试剂 (--)材料 待测植物(水稻、小麦、玉米、高梁、大豆等)叶片。 (二)仪器设备 分光光度计，研体，小烧杯，容量瓶，大试管，普通试管，移液管，注射器，水浴锅，漏斗，漏斗架,滤纸，剪刀。 (三)试剂 (1)酸性茚三酮溶液:将1.25g茚三酮溶于30mL冰醋酸和20ml 6mol/L磷酸中.搅拌加热(70℃)溶解，贮于冰箱中。 (2)3%磺基水杨酸:3g磺基水杨酸加蒸馏水溶剂解后定容至100mL (3)冰醋酸。 (4)甲苯。 三、实验步骤 1.标准曲线的绘制 (1)在分析天平上精确称取25 mg脯氨酸，倒人小烧杯内,用少量蒸馏水溶解，然后倒人250 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100ug。 (2)系列脯氨酸浓度的配制。取6个50mL容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5 mL、1.0mL、1.5 mL、2.0mL、2.5mL及3.0mL用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1 ug/mL、2 ug/mL、3 ug/mL、4 ug/mL、5 ug/mL及6ug/mL。 (3)取6支试管，分别吸取2mL系列标准浓度的脯氨酸溶液及2mL冰醋酸和2 mL酸性茚三酮溶液,每管在沸水浴中加热30 min。 (4)冷却后各试管准确加人4mL甲苯，探荡30s,前置片刻，使包素全部转至甲苯溶液。 (5)用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520 nm波长处进行比色。 (6)标准曲线的绘制:先求出吸光度值(y)依脯氨酸浓度(x)而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2 mL测定液中脯氨酸的含量(ug/mL)。 2.样品的测定 精品文档

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(1)脯氨酸的提取:准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g,分别置大管中，然后向各管分别加人5mL3%的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10 min(提取过程中要经常播动),冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。 (2)吸取2mL提取液于另一干净的带玻塞试管中，加人2mL冰醋酸及2 mL酸性茚三酮试剂，在佛水浴中加热30 min,溶液即呈红色。 (3)冷却后加人4 mL甲苯,摇荡30s，静置片刻，取上层液至10 mL离心管中，在3000 r/min下离心5 min。 (4)用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色,求得吸光度值。 四、结果计算 根据回归方程计算出(或从标准曲线上查出)2 mL测定液中脯氨酸的含量(ug/mL),然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下: 单位鲜重样品的脯氨酸含量= 样重 实验8-12丙二醛的测定 [实验原理] 植物器官在逆境条件下或衰老时，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是其产物之一,通常将其作为脂质过氧化指标，用于表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。 在酸性和高温的条件下，丙二醛可与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的3，5，5-三甲基噁唑-2，4-二酮，在532nm处有最大吸收波长。但该反应会受到可溶性糖的极大干扰，糖与TBA的反应产物在532 am处也有吸收，但其最大吸收波长在450 nm处。 植物在经受逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定中需排除可溶性糖的干扰，通常加人低浓度Fe+ (使其终浓度为0.5 nmol/L.植物组织中铁的含量一般为100~300 ug/g干重)，以显著增加TBA与糖的显色反应产物在450 am处的吸收。 采用双组分分光光度法可分别求出MDA和可溶性糖的含量。该法针对混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽有明显的差异，但吸收曲线彼此又有些重叠，可根据Lambert-Beer定律，通过代数方法，计算出一种组分由于另一种组分存在时对OD值的影响，最后分别得精品文档

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到两种组分的含量。 [器材与试剂] 1. 实验仪器 分光光度计，离心机，研磨器，恒温水浴锅，具塞试管。 2. 实验试剂 三氯乙酸，石英砂， 硫代巴比妥酸(TBA)溶液(用10% TCA配制0.6%的TBA溶液)。 3. 实验材料 盆栽小麦。 [实验步骤] 1.MDA的提取 盆栽小麦在抽德期停止浇水，进行干旱处理，取叶片1g将其剪碎，加入10%三氯乙酸(TCA)2mL和少量石英砂，研磨；进一步加人8mL TCA充分研磨，匀浆液以4000g离心10 min,上清液即为样品提取液。 2.显色反应及测定 吸取2mL提取液，加人2mL0.6% TBA液，混匀，在试管上加盖塞，置于沸水浴中沸煮15min，迅速冷却，离心。取上清液测定332mm和450 nm处的OD值。对照管以2ml水代替提取液。 3.计算 MDA与TBA反应产物的最大吸收峰在532 nm.TBA与可溶性糖(以蔗糖为例）的反应产物的最大吸收峰在450nm吸收曲线彼此又有重叠。得到方程： =6.45 根据公式即可计算样品提取液中MDA的含量，然后再计算每克样品中MDA的含量。 实验3-3叶绿素a、叶绿素b含量测定 【实验原理】 如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert -Beer 定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对OD值的影响，最后分别得到两种组分的含量。 叶绿素a的最大吸收峰在663 nm,叶绿素b在645 nm,吸收曲线彼此又有重叠。根据Lambert -Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的质量浓度ρ与光密精品文档

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度OD(A)之间有如下的关系: ρ ρρ ρ ρ 式中ρ 为总叶绿素质量浓度，单位是mg/L。利用上面公式，即可计算出叶绿素a和叶绿素b及总叶绿素的质量浓度(mg/L)。 【器材与试剂】 1.实验仪器 高级型分光光度计 ，离心机，台天平，剪刀，研钵，漏斗，移液管。 2.实验试剂 丙酮, CaCO3。 3. 实验材料 植物叶片。 【实验步骤】 1. 色素的提取 取新鲜叶片，剪去粗大的叶脉并剪成碎块，称取0.5 g放人研钵中加纯丙酮5 mL，少许CaCO和石英砂，研磨成匀浆，再加80%丙酮5mL,将匀浆转人离心管，并用适量80%丙酮洗涤研钵，并转入离心管,离心后弃沉淀， 上清液用80%丙酮定容至20 mL。 2. 测定OD值 取上述色素提取液1 mL,加80%丙酮4 mL稀释后转入比色杯中，以80%丙酮为对照，分别测定663 nm、645 nm处的OD值。 3.计算 按公式分别计算色素提取液中叶绿素a、叶绿素b及叶绿素a+b的浓度。再根据稀释倍数分别计算每克鲜重叶片中色素的含量。 【注意事项】 1.由于植物叶子中含有水分，故先用纯丙酮进行提取，以使色素提取液中丙酮的最终浓度近似80%。 2.由于叶绿素a、b的吸收峰很陡，仪器波长稍有偏差，就会使结果产生很大的误差，因精品文档

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此最好能用波长较正确的高级型分光光度计。 过氧化氢酶（CAT）活性测定 过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。 （1）试剂配制： 0.2mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4) 61.0 mL和B母液(NaH2PO4) 39.0 mL混合后至100mL。(加1gPVP) （2）反应液配制：吸取5.68mL30%的H2O2（原液）稀释至1000mL，摇匀即可。 （3）样品测定： 1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将容量瓶置4℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。4℃下保存备用. 2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管（加入酶液后在沸水中煮沸5-10min，冷却之后加入H2O2测定吸光值），按表40-2顺序加入试剂。 表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表 管号 S1 S2 S3 粗酶液(ml) 0.2 0.2 0.2 pH7.8磷酸(ml) 1.5 1.5 1.5 蒸馏水(ml) 1.0 1.0 1.0 25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。调零用磷酸缓冲液（pH=7.8） 3.结果计算： 以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。 过氧化氢酶活性(u/g/min)= A240×Vt/0.1×V1×t×FW 式中 A240 = AS0－ （AS1+AS2）/2；AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值；AS1, AS2—样品管吸光值；Vt—粗酶提取液总体积（ml）；V1—测定用粗酶液体积（ml）；FW—样品鲜重（g）； 0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min） 精品文档