蛋白免疫印迹（western blot）实验

实验步骤：

一、试剂准备

1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。

3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。

5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。

6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺 0.1 ml；H202 1.0 μl。【晶莱生物】

二、蛋白样品制备

1.单层贴壁细胞总蛋白的提取

（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。

（2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）

（4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）

（6）于4℃下12000 rpm离心5 min。（提前开离心机预冷）

（7）将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于－20℃保存。

2.组织中总蛋白的提取

（1）将少量组织块置于1～2 ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

（2） 加400 μL单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。

（3）几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。 （4） 裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5 ml离心管中，然后在4℃下12000 rpm离心5 min，取上清分装于0.5 ml离心管中并置于－20℃保存。

3.加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取

由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按1操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：

（1）将培养液倒至15 ml离心管中，于2500 rpm离心5 min。

（2）弃上清，加入4 ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500 rpm离心5 min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。

（3）用枪洗干上清后，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。 （4）将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm离心5 min，取上清分装于0.5 ml离心管中并置于－20℃保存。

三、 蛋白含量的测定

1.制作标准曲线

（1）从－20℃取出1 mg/ml BSA，室温融化后，备用。

（2）取18个1.5 ml离心管，3个一组，分别标记为0 mg，2.5 mg，5.0 mg，10.0 mg，20.0 mg，40.0 mg。

（3）按下表在各管中加入各种试剂。

（4） 混匀后，室温放置2 min。在生物分光光度计（Bio-Photometer，Eppendorf）上比色分析。

2.检测样品蛋白含量

（1）取足量的1.5 ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1 ml。室温放置30 min后即可用于测蛋白。

（2） 取一管考马斯亮蓝加0.15 mol/L NaCl溶液100 ml，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。

（3）弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5 mL），再用无菌水洗一次。

（4）取一管考马斯亮蓝加95 ml 0.15 mol/L NaCl NaCl溶液和5 ml待测蛋白样品，混匀后静置2 min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。

注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5 ml样品含的蛋白量。

四、SDS－PAGE电泳

1.清洗玻璃板

一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

2. 灌胶与上样

（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）

（2）按前面方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）

（3）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

（4）按前面方法配4%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

（5）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）