总RNA提取（TRIzol法）

仪器和材料：氯仿、异丙醇、无水乙醇、无RNA酶枪头（1000μL，200μL，

10μL）、移液枪、无RNA酶EP管（有1.5mL、2mL、15mL、50mL等不同规格）、75%乙醇（尽量现配现用，配制好后置于4℃冰箱待用）、滤纸、DEPC水、计时器记号笔等

注：上述材料标记好提RNA专用，自己保管好！

操作步骤：

1．细胞悬液按照每5×105~106个细胞加1mL TRIzol，贴壁细胞直接加TRIzol裂解，（1个T25cm2细胞培养瓶可加1~2mL TRIzol，可根据需求来添加），裂解数分钟（5~10分钟，可在倒置显微镜下观察细胞脱落情况），反复用枪吹打或持续振荡以裂解细胞。

2．将上述TRIzol裂解液转移至1.5mL EP管中，每个EP管做好标记，按照每1mL TRIzol加200μL氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，用力振荡（手动）15秒，在室温下放置10~15分钟（观察到明显分层即可）；然后4℃离心机12000rpm离心15分钟。

3．将离心后EP管内上层液体转入新的EP管内（离心后分为3层，注意吸取第一层水相时不要吸到第二层，一般可吸到500μL左右），按照每1mL TRIzol加500μL异丙醇的量加入异丙醇，盖上EP管盖子，轻轻颠倒混匀，在室温下放置10分钟，然后4℃离心机12000rpm离心10分钟。

4．轻轻弃掉上清，避免把沉淀倒走，如果是较多的贴壁细胞可观察白色的沉淀（上清或者少量细胞看不到），按照每1mL TRIzol添加1mL75%乙醇进行洗涤，上下颠倒混匀，室温放置5分钟，然后4℃离心机7500rpm离心5分钟。

5．轻轻弃掉上清液，将EP管管口倒置于滤纸上，吸掉残液，让沉淀的RNA在室温下自然干燥，5~15分钟（残留的水分不要太多，也不要晾的太干了）。

6．用DEPC水溶解RNA沉淀，一般为20μL（10~20μL均可，加入水量太多会导致单位体积RNA浓度过低）。

注意事项：

1.用TRIzol法提取RNA时，将离心机设置到4℃提前预冷，将离心机内擦拭干净（均在4℃温度下离心）；

2.操作台面用酒精擦拭，保持干净、整洁，佩戴手套，口罩、穿戴实验服； 3.所有加样需要在通风橱进行操作！

4.本方法适用于贴壁细胞，细胞悬液，动物组织；

5.如若在6孔板等细胞培养板里单独提取几个孔的RNA时，加入TRIzol后请用Hanks清洗至少两遍，残留的TRIzol会导致其他孔的培养细胞脱落；

6.如若当天不提取，加入TRIzol后的样品可置于-80℃超低温冰箱保存。提取后的RNA放置于冰盒上，最好马上进行反转录反应，隔天置于-20℃，超过3天放置于-80℃超低温冰箱贮存，RNA容易发生降解！