酵母蔗糖酶米氏常数的测定
[原理]
当环境的温度、pH和酶浓度等条件恒定时，酶促反应的初速度V随底物的浓度[S]增高而加快，直至达到一极限，即最大反应速度Vmax。根据底物浓度和反应速度的这种关系，Michaelis-Menten推导得出如下公式：
V =
Vmax [S]
Km +[S]
式中Km为米氏常数。它是酶的特征性常数。测定Km是研究酶的一项重要工作。大多数酶Km在10～10mol/L左右。但是Michaelis-Menten方程中反应速度V与底物浓度[S]之间为双曲线关系，通过作图求Km值极不方便。Lineweaver-Burk根据米氏方程又推导出如下直线方程：
1
= V
Km Vmax
· 1 [S]
+ 1 Vmax
-3
-5
以1/[S]为横坐标，1/V为纵坐标，将各点连成一直线，此线向左延长与横轴相交处即为米氏常数（Km）的负值。
本实验是用比色法测定一定时间内、一定量的蔗糖酶作用于不同浓度的底物（蔗糖）生成产物的量，即葡萄糖的量。此产物的生成量为反应速度，然后按Lineweaver-Burk双倒数作图法作图（图14），就可以求出Km值。
1
Km
1 Vmax 1 [S]
1 v 图14 Lineweaver-Burk双倒数作图法
[试剂]
1．0.03mol/L蔗糖溶液。
2．0.2mol/L pH5.0醋酸缓冲液：取0.2mol/L醋酸钠溶液70ml与0.2mol/L乙酸溶液
30ml相混合。
3．蔗糖酶溶液：干酵母2.5g置研钵中，加蒸馏水4ml，用力研磨10分钟，转移到离心管中，用25ml蒸馏水洗研钵，并将洗涤液一起转移到离心管中，摇匀，静置50分钟，离心（2000r/min 5min），小心取出上清夜备用。置冰箱保存。实验时根据需要用蒸馏水适当稀释。（约25倍稀释）
4．碱性硫酸铜溶液：取无水Na2CO340g溶于400ml蒸馏水中；酒石酸7.5g溶于350ml蒸馏水中；结晶硫酸铜（CuSO4·5H2O）4.5g溶于200ml蒸馏水中，以上分别加热促溶。冷却后将酒石酸溶液倾入Na2CO3溶液中，混匀。再将硫酸铜溶液倾入，并加蒸馏水至总量为1000ml。此试剂可在室温中长期保存。如放置数周后生成沉淀，可用优质滤纸过滤后使用。
5．磷钼酸试剂：烧杯内加入钼酸70g，钨酸钠10g，10%NaOH溶液400ml及蒸馏水400ml。煮沸20～40分钟以除去钼酸内可能存在的氨。冷却移入1000ml容量瓶内，加浓磷酸（85%）250ml，混匀。最后以蒸馏水稀释至1000ml。
6．葡萄糖标准溶液（0.05mg/ml）：
（1）葡萄糖标准贮存溶液：（10 mg/ml）：以分析天平称取1.000g纯葡萄糖，置于小烧杯中加0.25%苯甲酸溶液使溶解，倾入100ml容量瓶中以0.25%苯甲酸溶液稀释至刻度。
（2）葡萄糖标准应用液（0.05mg/ml）：用吸管吸取上述葡萄糖标准贮存液5.0ml放入1000ml容量瓶内，用0.25%苯甲酸溶液稀释致刻度。 [主要器材]
1. 恒温水浴及沸水浴 2. 721分光光度计 [主要操作步骤]
1. 将蔗糖酶溶液置30℃水浴预温5分钟。
2. 取试管5支，编号，按表14操作。 表14
试剂（ml）
管 号
1 2 3 4 5
0.03mol/L蔗糖溶液 5.0 2.5 1.5 1.0 0 蒸馏水 0 2.5 3.5 4.0 5.0 pH5.0醋酸缓冲液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
充分混匀，30℃水浴预温5分钟
蔗糖酶溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 立即混匀，30℃水浴准确保温10分钟
碱性硫酸铜溶液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
混匀，中止酶反应。
另取试管6支，编号。向1～5管加入上面相对应的5管反应液各0.5ml，再各加蒸馏水1.5 ml；第6管加入葡萄糖标准液2ml。然后按表15操作：
表15
试剂（ml）
管 号
1 2 3 4 5 6
碱性硫酸铜溶液 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 混匀，置沸水浴8分钟，取出冷却
磷钼酸试剂 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 混匀，静置3分钟
蒸馏水 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 将各管混匀，选用420nm波长比色，以第5管作为空白管调零，第6管作为标准管，记录各管光密度。 [结果与计算]
1～4号管酶促反应所产生的还原糖的?mol数按下式计算：
1000 7.0
还原糖(?mol) = ×0.1× ×
标准管光密度 0.5 180
按照Lineweaver-Burk作图法，以1/[S]为横坐标，10分钟内酶促反应产生的还原糖
测定管光密度
?mol的倒数1/v为纵坐标作图。将各点连成直线并延长此线与横轴相交点即为酵母蔗糖酶的Km值的负值。
本实验条件下测得的酵母蔗糖酶Km值约为4.2×10mol/L。
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