实验2 固定化糖化酶活力的测定

1 实验目的

（1）学习固定化糖化酶活力的测定方法。

（2）了解糖化型淀粉酶活力大小对工艺生产的指导意义。

2 实验原理

糖化型淀粉酶是一类酶的总称。共同特点是可以将淀粉水解成麦芽糖或葡萄糖，包括淀粉β-1，4-麦芽糖苷酶（β-淀粉酶）、淀粉α-1，4-葡萄糖糖苷酶（糖化酶）和淀粉β-1，6-葡萄糖苷酶（异淀粉酶）。本实验的研究对象是淀粉α-1，4-葡萄糖苷酶，它有催化淀粉水解的作用，从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1，4-糖苷键生成葡萄糖，反应生成的葡萄糖用碘量法定量测定，以表示糖化性淀粉酶的活力。

碘量法原理：淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖，葡萄糖具有还原性，其醛基易被弱氧化剂次碘酸盐所氧化。

I2+2NaOH→NaIO+NaI+H2O

NaIO+CH2OH(CHOH)4CHO→CH2OH(CHOH)4COOH+ NaI

体系中加入过量的碘，氧化反应完成用硫代硫酸钠标准溶液滴定过量的碘，则可计算出酶的活力。

I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+2NaI

3 仪器和试剂

3.1 主要仪器

吸管（25ml、10ml、5ml、2ml）、定碘瓶、碱式滴定管、恒温水浴锅、分析天平。 3.2 试剂

（1）2%可溶性淀粉

称取可溶性淀粉2g（预先100℃烘干约2h至恒重），用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入已沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至l00ml，此溶液需当天配制。

（2）0.2mol/L pH4.6醋酸钠缓冲液

称取醋酸钠(CH3COONa·3H2O)2.72g，用蒸馏水溶解，定容至100m1。冰醋酸(CH3COOH)1.17m1定容至100ml。分别取醋酸钠49ml和醋酸51ml混匀。缓冲液以酸度计或精密试纸校正pH。 （3）20%氢氧化钠溶液 （4）0.1mol/L碘液

称取碘化钾35g和碘13g溶解在100m1蒸馏水中，定容至 1000ml贮存于棕色瓶中。

（5）0.1mo1/L氢氧化钠溶液

称取4g氢氧化钠加蒸馏水溶解，定容至1000ml。

（6）1mol/L硫酸溶液

量取浓硫酸5.6ml，慢慢加入于80 m1蒸馏水中，冷却后定容至l00ml，摇匀。

（7）0.1mol/L硫代硫酸钠溶液

配制：称取结晶硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)24.82g和碳酸钠约0.2g（硫代硫酸钠溶液在pH9-10时最稳定）溶于煮沸后冷却的蒸馏水中（无CO2），定容至1000ml，即得0.1 mol/L硫代硫酸钠溶液。贮于棕色瓶中密封保存，配制后应放置一星期标定使用。

4 实验方法步骤

（1）固定化糖化酶的称量

称取实验一所得固定化糖化酶重量的2/15(相当于原酶液2mL)，待用。 （2）酶活力的测定

于甲、乙、丙三个三角瓶中，分别加入2%可溶性淀粉溶液25m1及0.2mol/L pH4.6的乙酸缓冲液5ml，摇匀，在40℃的恒温水浴中预热5-10min，在甲管中加入已经称量好的固定化酶（方法一），乙管中加入已经称量好的固定化酶（方法二），丙管加2ml蒸馏水作对照，摇匀，立即记时。准确反应1h后（加固定化酶的三角瓶在反应过程中应不断搅拌），取出各加20%NaOH溶液0.2m1终止酶反应，冷却至室温。

取上述反应液5m1放入碘量瓶中，准确加入0.1mol/L碘液10ml，再加入0.1mol/L氢氧化钠15ml，摇匀后暗处放置15min。加入1mol/L硫酸2m1，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至无色为终点。

5 结果计算

5.1 计算两种方法所得固定化糖化酶的活力

糖化酶活力单位的定义：在40℃、pH4.6的条件下，1小时水解可溶性淀粉产生1毫克葡萄糖所需的酶量为一个糖化酶活力单位。

酶活力单位=（A-B)N ×90.05 ×（1/2） ×（32.2/5） 式中 A——空白所消耗硫代硫酸钠体积（ml）； B——样品所消耗硫代硫酸钠体积（ml）； N——硫代硫酸钠浓度（0.1mol/L）；

90.05 ——1ml l mol/L硫代硫酸钠所相当的葡萄糖质量（mg）； 1/2 ——折算成1m1酶液的量 32.2——反应液总体积（ml） 5 ——吸取反应液样品的体积（ml）； 5.2 计算固定化酶的活力回收率

固定化酶总活力

固定化酶活力回收率=

用于固定化的酶的总活力

× 100%

6 思考题

（1）该实验中影响糖化酶活力单位测定值的因素主要有哪些？ （2）比较分析两种糖化酶固定化方法对其酶活性的影响？