固定化糖化酶活力的测定 下载本文

实验2 固定化糖化酶活力的测定

1 实验目的

(1)学习固定化糖化酶活力的测定方法。

(2)了解糖化型淀粉酶活力大小对工艺生产的指导意义。

2 实验原理

糖化型淀粉酶是一类酶的总称。共同特点是可以将淀粉水解成麦芽糖或葡萄糖,包括淀粉β-1,4-麦芽糖苷酶(β-淀粉酶)、淀粉α-1,4-葡萄糖糖苷酶(糖化酶)和淀粉β-1,6-葡萄糖苷酶(异淀粉酶)。本实验的研究对象是淀粉α-1,4-葡萄糖苷酶,它有催化淀粉水解的作用,从淀粉分子非还原性末端开始,分解α-1,4-糖苷键生成葡萄糖,反应生成的葡萄糖用碘量法定量测定,以表示糖化性淀粉酶的活力。

碘量法原理:淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖,葡萄糖具有还原性,其醛基易被弱氧化剂次碘酸盐所氧化。

I2+2NaOH→NaIO+NaI+H2O

NaIO+CH2OH(CHOH)4CHO→CH2OH(CHOH)4COOH+ NaI

体系中加入过量的碘,氧化反应完成用硫代硫酸钠标准溶液滴定过量的碘,则可计算出酶的活力。

I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+2NaI

3 仪器和试剂

3.1 主要仪器

吸管(25ml、10ml、5ml、2ml)、定碘瓶、碱式滴定管、恒温水浴锅、分析天平。 3.2 试剂

(1)2%可溶性淀粉

称取可溶性淀粉2g(预先100℃烘干约2h至恒重),用少量蒸馏水调匀,徐徐倾入已沸的蒸馏水中,煮沸至透明,冷却定容至l00ml,此溶液需当天配制。

(2)0.2mol/L pH4.6醋酸钠缓冲液

称取醋酸钠(CH3COONa·3H2O)2.72g,用蒸馏水溶解,定容至100m1。冰醋酸(CH3COOH)1.17m1定容至100ml。分别取醋酸钠49ml和醋酸51ml混匀。缓冲液以酸度计或精密试纸校正pH。 (3)20%氢氧化钠溶液 (4)0.1mol/L碘液

称取碘化钾35g和碘13g溶解在100m1蒸馏水中,定容至 1000ml贮存于棕色瓶中。

(5)0.1mo1/L氢氧化钠溶液

称取4g氢氧化钠加蒸馏水溶解,定容至1000ml。

(6)1mol/L硫酸溶液

量取浓硫酸5.6ml,慢慢加入于80 m1蒸馏水中,冷却后定容至l00ml,摇匀。

(7)0.1mol/L硫代硫酸钠溶液

配制:称取结晶硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)24.82g和碳酸钠约0.2g(硫代硫酸钠溶液在pH9-10时最稳定)溶于煮沸后冷却的蒸馏水中(无CO2),定容至1000ml,即得0.1 mol/L硫代硫酸钠溶液。贮于棕色瓶中密封保存,配制后应放置一星期标定使用。

4 实验方法步骤

(1)固定化糖化酶的称量

称取实验一所得固定化糖化酶重量的2/15(相当于原酶液2mL),待用。 (2)酶活力的测定

于甲、乙、丙三个三角瓶中,分别加入2%可溶性淀粉溶液25m1及0.2mol/L pH4.6的乙酸缓冲液5ml,摇匀,在40℃的恒温水浴中预热5-10min,在甲管中加入已经称量好的固定化酶(方法一),乙管中加入已经称量好的固定化酶(方法二),丙管加2ml蒸馏水作对照,摇匀,立即记时。准确反应1h后(加固定化酶的三角瓶在反应过程中应不断搅拌),取出各加20%NaOH溶液0.2m1终止酶反应,冷却至室温。

取上述反应液5m1放入碘量瓶中,准确加入0.1mol/L碘液10ml,再加入0.1mol/L氢氧化钠15ml,摇匀后暗处放置15min。加入1mol/L硫酸2m1,用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至无色为终点。

5 结果计算

5.1 计算两种方法所得固定化糖化酶的活力

糖化酶活力单位的定义:在40℃、pH4.6的条件下,1小时水解可溶性淀粉产生1毫克葡萄糖所需的酶量为一个糖化酶活力单位。

酶活力单位=(A-B)N ×90.05 ×(1/2) ×(32.2/5) 式中 A——空白所消耗硫代硫酸钠体积(ml); B——样品所消耗硫代硫酸钠体积(ml); N——硫代硫酸钠浓度(0.1mol/L);

90.05 ——1ml l mol/L硫代硫酸钠所相当的葡萄糖质量(mg); 1/2 ——折算成1m1酶液的量 32.2——反应液总体积(ml) 5 ——吸取反应液样品的体积(ml); 5.2 计算固定化酶的活力回收率

固定化酶总活力

固定化酶活力回收率=

用于固定化的酶的总活力

× 100%

6 思考题

(1)该实验中影响糖化酶活力单位测定值的因素主要有哪些? (2)比较分析两种糖化酶固定化方法对其酶活性的影响?