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(2)单克隆稳转株：建立在获得多克隆稳转株基础上。 A、有限稀释法：

a.取24个1.5毫升EP管，每管中加入800毫升完全培养基； b.用胰酶将多克隆稳转株消化（90%融合度，10毫升培养基终止消化），取80微升至第一个EP管中，混合均匀；

注：应使用1000微升枪尖，混合时不要过度吸打，以免破坏细胞。 c.从第一个EP管中取80微升至第二个EP管中，混合均匀，以此类推。 d.将EP管中的细胞悬液，以每孔100微升，接种于96孔板中； e.过夜培养后，观察第12-24列，寻找只含有1个细胞的孔，并做好标记；

f.培养3-4周，待标记孔中细胞扩增后，消化传代扩增，即为单克隆稳转株细胞。

注：培养的第一周不要换液，接下来每3-4天换液。 B、平板挑取法

a.计数100个多克隆稳转株细胞，接种于一个10cm培养盘中； 注：尽量吹打均匀，防止细胞聚团。

b.过夜培养后，观察并寻找单个细胞的位置，并在盘底做标记；

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c.培养2周；

注：培养的第一周不要换液，接下来每3-4天换液。

d.待标记处的细胞扩增为肉眼可见的白点，使用10微升移液器，调至最大量程，在尖端吸取一点胰酶（约5微升，且尖端为空气），缓慢滴至白点处，保持枪尖静置在白点上，且不让胰酶留出白点所在范围，1min后，迅速吹打，将消化下的细胞转移至96孔板中，传代扩增，即为单克隆稳转株细胞。约需2-3周。

注：每盘选取20个为宜，在消化时，需按照先消化边缘的，再消化中心的原则，防止克隆之前的相互污染。培养的第一周不要换液，接下来每3-4天换液。

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