实验十四 血清胆固醇测定
(胆固醇氧化酶法)
胆固醇的测定方法很多;通常可分为化学试剂比色法、酶法、气相色谱法、高效液相色谱法、核素稀释质谱法五大类。化学试剂比色法中有直接法和间接法;前者可用血清直接测定,后者是用溶剂或其它方法提取胆固醇后再作定量。酶法由于操作简便、结果准确,试剂无腐蚀性,而且因使用特异性酶,大大减少了血液中其它成分的干扰,目前已成为测定胆固醇的主要方法。
【目的】
1.了解胆固醇氧化酶法测定血清胆固醇的原理,能进行血清胆固醇测定的操作。 2.掌握血清胆固醇测定的临床意义。 【原理】
血清中总胆固醇(TC)包括胆固醇酯(CE)和游离型胆固醇(FC),酯型占70%,游离型占30%。胆固醇酯酶(CEH)先将胆固醇酯水解为胆固醇和游离脂肪酸(FFA),胆固醇在胆固醇氧化酶(COD)的作用下氧化生成Δ-胆甾烯酮和过氧化氢。后者经过氧化物酶(POD)催化氢与4-氨基安替比林(4-AAP)和酚反应,生成红色的醌亚胺,其颜色深浅与胆固醇的含量呈正比,在500nm波长处测定吸光度,与标准管比较可计算出血清胆固醇的含量。反应式如下:
胆固醇酯胆固醇 + O2CEHCOD4
胆固醇 + 脂肪酸△4-胆甾烯酮 + H2O2POD2H2O2 + 4-氨基安替比林 + 酚红色醌亚胺
【器材】
试管、吸管、试管架、微量加样器、恒温水浴箱、分光光度计。 【试剂】
酶法测定胆固醇多采用市售试剂盒。 1. 酶应用液 胆固醇酶试剂的组成为: pH6.7磷酸盐缓冲液 50mmol/L 胆固醇酯酶 ≥200U/L 胆固醇氧化酶 ≥100U/L 过氧化物酶 ≥3 000U/L 4-氨基安替比林 0.3 mmol/L
苯酚 5 mmol/L
此外还含有胆酸钠和Triton X-100,胆酸钠是胆固醇酯酶的激活剂,表面活性剂Triton X-100能促进脂蛋白释放胆固醇和胆固醇酯,有利于胆固醇酯的水解。
2. 5.17 mmol/L(200mg /dl)胆固醇标准液
精确称取胆固醇 200mg溶于无水乙醇,移入100ml容量瓶中,用无水乙醇稀释至刻度(也可用异丙醇等配制)。
【操作】
取试管3支,编号,按下操作。
表3-15 酶法测定血清胆固醇操作步骤
加入物(ml)
血清 胆固醇标准液 蒸馏水 酶应用液
混匀后,37℃水浴保温15分钟,在500nm波长处比色,以空白管调零,读取各管吸光度。
【计算】
测定管 0.02 - - 2.00
标准管 - 0.02 - 2.00
空白管 - - 0.02 2.00
血清胆固醇 (mmol/L) = 【注意事项】
测定管吸光度标准管吸光度× 5.17
1. 黄疸血清过高的胆红素可还原—部分反应中的H2O2,降低显色反应,使结果偏低。但测定胆固醇,胆红素对酶法的干扰比化学法小。
2. 用胆固醇标准液引起的误差较大,故目前提倡采用胆固醇定值血清为标准。 3. 轻度溶血对测定结果无影响,但明显溶血可使结果增高,此时可用一个不加COD的空白管从结果中减去后纠正。
4. 其它影响因素,如维生素C、谷胱甘肽、氟化物引起负偏差。 【正常参考范围】 3.10~5.70mmol/L 【临床意义】
1. 血清胆固醇增高 常见于动脉粥样硬化、原发性高脂血症、糖尿病、肾病综合征、
胆管阻塞、甲状腺功能减退。
2. 血清胆固醇降低 常见严重贫血、甲状腺功能亢进、长期营养不良等。 【结果及分析】
【思考题】
1.胆固醇有哪些重要的生理功能,血清胆固醇升高对机体最严重的危害是什么? 2.胆固醇在体内可转变为哪些物质,如何排泄? 3.实验中需要哪几种酶参加,各有什么作用?