总RNA的提取及纯化

(用于小规模提取RNA)

实验前的注意事项及准备过程 ? 植物材料量的正确估计，这不仅关系到RNA的提取量，还直接影响到下一步RNA的纯化质量。 ? 实验器皿应用DEPC水或高温处理 提取总RNA (用Invitrogen 的TRIZOL提取液)：

1. 收集100-200mg组织, 用液氮将组织材料充分研磨成粉末。

2. 待液氮挥发干, 立即加入TRIZOL提取液, 每100-200mg 组织中 加入1ml的TRIZOL提取液，涡旋使样品充分裂解，室温放置5分钟。

3. 加入0.2ml 氯仿 (chloroform) 剧烈振荡混匀15秒钟, 室温放置10分钟。 4. 4℃，12000rpm离心10min，转移上清到新的2ml的离心管, 加入0.5ml (或0.5×开始体积)的RNase-free水, 再加入1ml 的异丙醇 (1:1体积)，充分混匀, 室温放置10分钟沉淀。

5. 4℃，12000rpm离心10min，去除上清1，沉淀中加入1ml 75%的乙醇洗涤RNA沉淀，4℃，8000rpm离心15min。

6. 去上清，小心不要搅动沉淀，RNA空气中晾干约10-15分钟2，加入100?l体积的RNase-free水充分溶解3. (可放于-80oC长期保存) 。 7. 用紫外分光光度计

4，5

及1%Agrose 电泳胶检测RNA浓度及质量。（通常产量

是1g叶组织可以提取出500μg RNA）

注意事项: 1. 异丙醇沉淀样品离心后勿将上清倒掉，先将其保留于一干净的EP管中。 2. 干燥RNA时不需要太干，室温放置15分钟即可，中间可轻弹管底，使残留液体弹至管壁上，促进液体尽快挥发。 3. 溶解RNA样品时先弹拨EP管，待样品全溶后用枪反复吹吸，使其充分混匀。 4. 测OD值时要每个样品读数3次，取平均值。 5. 样品260nm/280nm比值的高低与溶解RNA的水有关，如果以TE为稀释液进行紫外检测，260nm/280nm比值会更接近1.9～2.1。 纯化总RNA (用Qiagen公司的Rneasy Mini Kit, Cat#74104):

实验前的注意事项及准备过程 ? Rneasy plant Mini Kit有两种裂解液，标号分别为RLT和 RLC，他们的组成分别是异硫氰酸胍和氰氯化胍。RLT为常用裂解液，有强的破坏组织和降解蛋白的能力，RLC主要用于象玉米的胚乳及真菌的菌丝的RNA的提取，GITC能凝固这些组织。 ? β-ME（巯基乙醇）的预先加入，每1毫升的RLT和 RLC裂解液需加入10μL 的β-ME，β-ME在裂解液中最多可稳定1个月。 ? RPE是浓缩液，使用前需加入4倍体积的无水乙醇。 ? 整个提取过程是常温操作，所有的离心步骤温度保持在20-25℃，温度一定不能低于20℃。 8. 取RNA 80-90μg RNA，加RNase-free的水将体积调整到100μL

9. 加入350μL的RLT工作液, 涡旋混匀，加250μL无水乙醇a)，用Tip头充分混匀。

10. 将混合的700μL溶液直接加入QIAshredder spin column（粉色的柱子)，室温静放1分钟，2000 rpm离心5分钟。

11. 倒掉收集管中的流出液, 在柱中加入500μL RPE Buffer，10000rpm离心1分钟。

12. 倒掉收集管中的流出液, 再加入500μL RPE Buffer到柱中, 10000rpm离心1min。

13. 将纯化柱放入新的收集管中, 最大转速b), 离心1分钟。

14. 将纯化柱放入1.5ml离心管中，吸取30μL RNase-free 的水直接加至纯化柱膜中间c)，室温放置5分钟, 5000rpm离心5分钟。

15. 再吸取30μL RNase-free 的水直接加至纯化柱膜中间，室温放置5分钟, 5000rpm离心5分钟。

16. 10000rpm离心1分钟, 收集液体d)。 17. 定量检测RNA:

a) 吸取1μL cRNA (cellular RNA)混入69 μL RNase-free 的水 (1×TE Buffer),

测量OD值. OD260/280 及OD260/230 尽量达到1.9~2.1。

b) 1%Agarose 电泳胶检测RNA的质量及大小. 吸取1μL RNA混入4 μL的电

泳染色液中 (Sigma), 65oC变性5分钟. 取1μL的1kb DNA marker 加1μL的电泳染色液, 并加6μL的RNase-free 的水. 把样品点到Agrose 胶中。

注意事项: a) 加入无水乙醇后用枪头反复吹吸混匀样品。 b) 用Qiagen公司试剂盒纯化时，离心转速不要太大，以防纯化柱内滤膜无法承受，达不到纯化的效果。 c) 洗脱RNA时，分2次30ul进行，每次加水要加到滤膜中心。 d) 纯化柱洗脱完毕后不要丢弃，防止未洗脱完全。 e) DNA是否需要去除干净（Rnase-Dnase cat No.：79254）