生物化学实验

醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白质

一、实验目的

掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法

二、实验原理

蛋白质是两性电解质。在pH值小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH值大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，故可利用电泳法将它们分离。

血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸祖坟、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值7.0，所以在

pH8.6的缓冲液中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。 蛋白质名称 等电点 相对分子质量 白蛋白 4.88 69000 α1-球蛋白 5.06 200000 α2-球蛋白 5.06 300000 β-球蛋白 5.12 90000~150000 γ-球蛋白 6.85~7.50 156000~300000 在一定范围内，蛋白质的含量与结合的燃染料量成正比，故可将蛋白质区带剪下，分别用0.4mol/L NaOH溶液浸洗下来，进行比色，测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量。

肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使白蛋白下降。肾病时α1、α2、β球蛋白升高，γ-球蛋白降低。肝硬化时α2、β-球蛋白降低，而α1、γ-球蛋白升高。

三、实验器材

1、醋酸纤维薄膜（2cm*8cm，厚度120μm） 2、人血清；

3、烧杯及培养皿 数只； 4、点样器； 5、竹镊子； 6、玻璃棒； 7、电吹风； 8、试管 六只； 9、恒温水浴锅； 10、电泳槽；

11、直流稳压电泳仪； 12、7220型分光光度计； 13、剪刀

四、实验试剂

1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液：取两个大烧杯，分别称取巴比妥钠和巴比妥溶解于500ml蒸馏水中；

2、染色液，可反复使用；

3、漂洗液：取乙醇45ml，冰醋酸10ml，混匀； 4、浸出液：0.4mol/L NaOH溶液；

5、透明液：取冰醋酸25ml、无水乙醇75ml，混匀。

五、实验操作

1、准备和点样

取一条醋酸纤维薄膜，浸入缓冲液中，完全浸透后，用镊子轻轻取出，将薄膜无光泽的一面向上，平放在干净滤纸上，再放一张干净滤纸吸取多余的缓冲液；

用玻棒蘸取少量血清，涂在点样器上，然后轻轻于距纤维薄膜一端1.5cm处接触，样品即呈一条状突于纤维膜上。待血清透入膜内，将薄膜平贴于已放在电泳槽上、并已浸透缓冲液的纱布上，点样端为阴极；

2、电泳

接通电源，设定电泳电压为100V，通电50分钟； 3、染色

电泳完毕，将薄膜浸于染色液中10分钟，取出，用漂洗液漂至背景无色，再浸于蒸馏水中；

4、定量

将漂净的薄膜用滤纸吸干，剪下薄膜上各条蛋白质色带，另取一条与各区带近似宽度的无蛋白附着的空白薄膜，分别浸于4.0ml 0.4mol/L NaOH溶液中，37℃水浴10分钟，色泽浸出后，用7220型分光光度计在590nm处比色，以空白膜条洗出液为空白调零，测定各管的吸光度。

5、透明

另外取电泳好的薄膜，待其完全干燥后，浸入透明液中20分钟，取出，平贴于干净玻片上，干燥，即得背景透明的电泳图谱。

六、实验数据记录

蛋白质名称 吸光度 各组分比率% 白蛋白 α1-球蛋白 α2-球蛋白 β-球蛋白 γ-球蛋白 0.504 0.038 0.052 0.097 0.083 65.1 4.9 6.7 12.5 10.8 设各部分吸光率为：A白、A?1、A?2、A?、A?。则吸光度总合为：

A总= A白+ A?1+A?2+A?+A?=0.774 白蛋白比率=A白/A总=0.651 α1-球蛋白比率=A?1/A总=0.049

α2-球蛋白比率=A?2/A总=0.067 β-球蛋白比率=A?/A总=0.125 γ-球蛋白比率=A?/A总=0.108

七、实验讨论与总结

1、什么是血清

将抽取的血液置入不加抗凝剂的试管中，使血凝固，析出的上清液就是血清。血清中所含的蛋白成分与血浆相比，少了纤维蛋白原，而主要是白蛋白、球蛋白。

2、由于蛋白的绝大部分均由肝脏合成，所以，各种蛋白质的质与量的变化，除与免疫性疾病等有关外，主要反映肝脏的生理、病理情况。

3、醋酸纤维素薄膜

醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有匀一的泡沫状结构，是由醋酸纤维素加工制成的。醋酸纤维素薄膜作为是电泳支持体有以下优点：①电泳后区带界限清晰；②通电时间较短（二十分钟至一小时）；③它对各种蛋白质（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都几乎完全不吸附，因此无拖尾现象；④对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完全无色。它的电渗作用虽高但很均一，不影响样品的分离效果，由于醋酸纤维素薄膜吸水量较低，因此必需在密闭的容器中进行电泳，并使用较低有电流避免蒸发。

醋酸纤维素薄膜经1,4－二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透明，因而可得背景为无色的电泳图谱。

4、血清提取蛋白

从血清中提取的蛋白质，适用于食品工业的食品添加剂和医药制剂。

通常提取蛋白质的方法是离心分离，除去血浆，使二价铁血红素酸化，并将其排除。

制作方法 ：取经过稳定的血液，作离心分离15～30分钟，每分钟转速为2 500～3 000转。从而取得固形物，去除血浆，用水使固形物沉渣溶解。置血红素于培养基中。为了使培养基酸化而使血红素分子中的二价铁血红素和血球蛋白的结合体分离 预先制备好醋酸和氯化钠的混合物 并将它加热到90～110℃。混合时将固形物的溶血产物缓慢地添加到加热的混合物中。重新把温度逐渐地升高到沸点，煮沸5～15分钟，以便使结合体完全分离，接着将混合物逐步冷却到室温。为了使二价铁血红素溶解并消除，在混合物中按溶物产物比值2∶1～5∶1添加乙醚。这时提取出来的蛋白质呈白棉絮状。将溶液过滤，再用乙醚清洗。100毫升血中提取的蛋白质产品相当于14.4克。应用这种方法，每100毫升的血液可提高蛋白质得率45%。

5、实验总结