Western blot 详细步骤

1、 按厂商的说明安装两套灌胶装置。

2、 Histone H3 的分子量为15.4kD ，故分离胶浓度为15％，按下表配制10ml ：

水 2.3ml

30%丙稀酰胺混合液 5.0ml 4×分离胶缓冲液 2.5ml 10％过硫酸铵 0.1ml TEMED 0.004ml

3、 迅速混合均匀后，灌胶两块，至适当高度。 4、 以水饱和正丁醇封盖。 5、 室温下聚合（约需30分钟）。

6、 倾去覆盖层，以去离子水轻洗，倾去水，以纸巾小心吸去剩余的水。于界面上用marker 笔做好标记。

7、 按下表配制5％积层胶 4ml ： 水 2.7ml

30%丙稀酰胺混合液 0.67ml 4×积层胶缓冲液 0.5ml 10％过硫酸铵 0.04ml

TEMED 0.004ml

8、 迅速混匀，加到聚合好的分离胶上，直至加满并排出气泡。分别插入洗净的梳子。室温下聚合。

9、 将聚合好的两块胶安装至电泳槽中，梳子朝内。 10、 将10×电泳缓冲液以去离子水稀释10倍，需700ml 。 11、 将电泳缓冲液从两块胶之间的凹槽中慢慢加入。

12、 将marker 及样品水浴煮沸5分钟，上样（尽量使用中间的泳道，未使用的以1×loading buffer 补上），每孔上样15微升。

13、 接好电源，黑对黑，红对红，积层胶电压为80V 。 14、 待溴酚兰跑至分界处，将电压调为120V 。 15、 继续电泳，待溴酚兰刚跑出胶时，终止电泳。

16、 小心取下两块胶，其中一块以考马斯亮兰染色。以记号笔在玻璃板上画好标记线，依线小心切去积层胶及两边未加样泳道，并在凝胶底部最靠近左边（第一个上样槽）切去一角，以示电泳方向及加样方向。

17、 同法操作另一块胶（以记号笔在玻璃板上画好标记线，小心切去积层胶及两边未加样泳道，并在凝胶底部最靠近左边（第一个上样槽）切去一角，以示电泳方向及加样方向）。以做western blot。

18、 剪下同样大小的0.2μM 的PVDF 膜（蛋白分子量大的话，可用0.45的膜），以甲醇浸泡3分钟。后水洗2分钟。

19、 剪下6张同样大小的whatman 纸，与PVDF 膜、胶同时以转移缓冲液平衡15分钟。

20、 按转膜装置的说明放置纸、膜、胶、纸（由下往上），转膜电流为0.65 mA/cm2 （经验，蛋白不同所需电流不同），时间约需1.5至2小时。放置时一定要排除气泡，特别是膜与纸、胶与膜、纸与胶之间。

21、 转完后，取出膜，在与胶相同的位置小心剪去一角，标示电泳方向及吸附有蛋白的

膜面。

22、 将转有蛋白的膜用丽春红染色10分钟，标示分子量Marker 。 23、 水脱色10分钟。

24、 根据Marker 判断β－actin 及目的蛋白所在位置，小心剪开。 25、 以5％脱脂奶粉封室温振摇封闭膜1小时。 26、 以1×TBS 洗膜三次。

27、 一抗用TBS 以1：1000稀释（一般1ml ），于杂交袋中加于转有蛋白的膜面，冰箱

孵育过夜。

28、 以1×TBS 洗膜三次，每次10分钟。

29、 二抗（碱性磷酸酶标记抗兔IgG ）用TBS 以1：100稀释（一般1ml ），于杂交袋中

加于转有蛋白的膜面，室温孵育2小时。 30、 以1×TBS 洗膜三次，每次10分钟。

31、 加入4ml 碱性磷酸酶缓冲液，再加入23微升NBT,13微升BCIP ，暗处显色。