龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn

半定量RT-PCR技术的研究及应用

作者：金凤媚 薛 俊 郏艳红 刘仲齐 来源：《天津农业科学》2008年第01期

摘要：介绍了半定量逆转录多聚合酶链式反应(RT-PCR)技术的原理和实验过程中潜在的问题，并且讨论了该技术在实际中的应用。 关键词：半定量RT-PCR；反应参数；应用

中图分类号：Q503文献标识码：A文章编号：1006—6500(2008)01—0010—04

高等生物基因表达的变化是调控细胞生命活动的核心机制，正是由于基因的差异表达才决定了生物体的所有生命过程。因此，研究不同类型细胞或同一类细胞在不同发育时期或不同发育状态下基因表达的变化，已成为当今生物学的研究热点之一。半定量逆转录多聚合酶链式反应(RT-PCR，Reverse transcription polymerase chain reac-tion)技术是近年来发展起来的探讨基因转录水平的有效手段。与传统的Northern blot法比较，它具有灵敏、简捷、特异性高等优点，因此在检测基因的表达水平上得到了广泛的应用。 1 原理

半定量RT-PCR技术的核心即PCR，是20世纪80年代末出现的一种相对定量的技术。当人们欲利用该技术研究并揭示某一基因的表达产物量的改变时，利用相同量的RNA进行反转录后，再PCR扩增，然后将扩增产物进行电泳判断量的差异。为避免样本间模板质量和扩增效率的差异而导致最终结果的差异，在PCR反应体系中引入了内对照系统。在一般情况下大多选用与靶基因序列无关的管家基因，如β-肌动蛋白(β-actin)和甘油-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)等，因为这些基因的转录比较稳定，含量相对丰富。将RNA逆转录为cDNA后，使靶基因和“管家基因”在同管或异管中一起扩增，在对扩增产物进行分析时，首先根据各样本间“管家基因”扩增条带密度是否一致，粗略地判断各样本抽提的效率、质量和扩增效率是否一致，然后以“管家基因”扩增产物条带的密度作为标准，计算出靶基因扩增条带密度与其之比值，并通过观察各样本扩增产物的比值，得出靶基因的表达量的相对变化。

2 反应参数

龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn

2.1 RNA的质量

在运用半定量RT-PCR方法检测特异基因表达量的差异时，总RNA的质量至关重要，只有在总RNA未被降解的情况下，才能保证其中mRNA的完整性，从而真实反映起始模板中基因表达量的差异。因此，每个RNA样品须检查其完整性和纯度，可以通过琼脂糖或甲醛变性电泳分析证明总RNA的完整性，一般在电泳图上会出现两条带28S和18S，且28S的亮度应是18S的两倍。半定量RT-PCR检测体系必须防止混在RNA中的基因组DNA带来的假阳性，所以在抽提后一定要用DNA酶消解残存在样品中的DNA。

2.2 逆转录(RT)

逆转录酶AMV或M-MLV能有效地逆转录RNA，合成模板cDNA，加Rnasin(RNA酶抑制剂)，可获得最高产量。实验证明，cDNA合成后残留的完整mRNA模板干扰RT-PCR，因为它与cDNA竞争作为PCR模板，而AMV和M-MLV反转录酶的内在RNaseH活性足以降解残存的大多数mRNA模板。但使用缺乏RnaseH活性的反转录酶时，则必须用RnaseH处理cDNA。

在逆转录过程中另一个需要考虑的情况是低拷贝RNA的反转录效率要低于高拷贝RNA，尤其是在反转录过程中存在大量非特异和背景RNA时，这种情况更为明显，因此反转录过程中的线性问题应该认真考虑。解决该问题的方法是每个PCR反应进行重复，看每次重复的变化程度，如果每次重复的结果变化很大，说明可能发生了不稳定随机现象。

2.3 模板量和反应循环数

设计相对定量PCR实验方案时必须注意预先确定最佳模板量和PCR反应的循环数。PCR扩增反应是酶促反应，遵循酶促反应定律，开始的循环内扩增产物呈指数累积，产物与模板呈线性关系。半定量RT-PCR技术正是利用产物与模板量的这一线性关系，通过扩增产物来对比总RNA中目的基因的表达。但经过一定的循环后，PCR产物不再呈指数累积而进入平台期，因此，为避免平台效应的影响，合适的循环数是PCR半定量方法的关键因素之一。循环次数因扩增目的条带不同而不同，陈昕等在建立小麦硫蛋白基因半定量RT-PCR检测方法时，目的基因和内参的循环次数分别为30和24次。石艳丽等人在用此方法测定链球菌透明质酸合酶mRNA的水平时，实验结果目的基因和内参的循环次数分别为30和35次。卢建雄等在检测生脂基因时则均确定为28次。Kim在研究垂体瘤细胞时循环次数为26次。

龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn

在逆转录之前，总RNA的定量也是实验的关键步骤，用等量的RNA作为起始模板，从而保证随后的PCR扩增条带亮度的差异，能够真实反映基因表达的实际情况。

2.4 Mg2+浓度对扩增效率的影响

Mg2+是影响Taq酶扩增效率的重要因素，浓度范围在0.5～5mmol/L，但扩增效率视序列而定。徐春兰等的研究表明Mg2+对细胞谷胱甘肽过氧化物酶基因扩增的影响较大，浓度在0.5～1mmol/L时，扩增效率不理想，条带较淡，进一步应用分析软件对电泳条带IOD值进行分析时发现，在1.5mmol/L时扩增效率及特异性良好。而对于小麦硫蛋白基因的检测结果，能同时稳定扩增目的基因和内参的Mg2+浓度分别为1.7mmol/L和1.9mmol/L。

2.5 引物的影响

2.5.1 引物间的竞争 利用RT-PCR技术对mRNA进行检测时一般要在同一管中对内参照和目的基因进行扩增。要在同一管中有效扩增出内参照和目的基因产物，并在凝胶电泳上清晰显现，同时消除引物对间可能的竞争，在设计引物时，除满足引物设计的基本要求外，还应考虑引物扩增的预期退火温度，特异基因和内参照引物的预期退火温度尽量相符；引物序列进行比对时，二者应无同源性；产物长度应有一定差异，以免电泳时重叠。如果目的基因与内参基因的扩增动态曲线表明，二者处于线性期的循环次数相差过大，却直接同管扩增，则两者的产物量受到竞争，扩增效率降低，这时可选用同批异管扩增，并在不同循环次数下分别取出二产物。

2.5.2 引物的设计 在选择PCR引物时，尽量使上游和下游引物跨越不同外显子，这样能把从cD-NA得到的扩增产物和从任何污染的包含内含子序列的基因组DNA得到的产物区分开(图1)。最佳的序列引物是完全精确与cDNA模板互补，在cDNA序列中，定位模板引物的重要理由是：(1)它确定PCR产物长度，应选择扩增400～2000bp产物的模板引物位点，因为小于400bp的扩增产物，需要高分辨率的特殊琼脂糖凝胶区分，并且引物和引物假象可导致模