2015版微生物限度检查方法验证方案 下载本文

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稀释液及溶液(消毒剂)名称 □pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 □pH6.8无菌磷酸盐缓冲液 0.9%无菌氯化钠溶液 含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液 □0.2%新洁尔灭溶液 □75%乙醇溶液 2.6.实验方法

配制批号 有效期至 中国药典(2015年版) 四部:(1105)非无菌产品微生物限度检查:微生物计数法; (1106)非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法。 2.7.人员资质

验证操作人员应具备微生物限度检查上岗资质,且在验证实施前应对其批准的验证方案进行培训,应能证明验证人员能依照验证方案正确实施。 培训时间 培训人 参加培训人员 确认人: 确认日期:

复核人: 复核日期:

溯源资料

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六、验证内容

1.供试液的制备

1.1.取供试品10g,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,充分振摇使混匀,作为1:10的供试液。

1.2.取1:10供试品10ml,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,充分振摇使混匀,作为1:100的供试液。

1.3.取1:100供试品10ml,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,充分振摇使混匀,作为1:1000的供试液。

备注:供试液制备若需加温时,应均匀加热,且温度不超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1小时。

2.菌液制备

2.1.接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养

物至胰酪大豆胨液体培养基中,30?35℃培养18~24小时;分别取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液,依次稀释至 、 、 、 制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。 2.2.接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中,20?25℃培养2~3 天;取此培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液,依次稀释至 ,制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。

2.3.将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上,20?25℃培养5 ?7天,使大量的孢子成熟。加入3-5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液,将孢子洗脱。然后,采用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内,用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液依次稀释至 ,制成每 1ml 含孢子数小于100cfu 的孢子悬液。

2.4.上述菌悬液制备后若在室温下放置,应在2小时之内使用;若保存在2~8℃,可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃,在验证过的贮存有效期

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内使用。 3.计数方法的验证

3.1.需氧菌、霉菌及酵母菌计数(平皿法)

所加菌液的体积不得超过供试液体积的1%。为确认供试品中的微生物能被充分 检出,首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性检查。 3.1.1.试验组

取上述制备好的供试液,加入试验菌液、混匀,使每1ml供试液或每张滤膜过滤 的供试液中含菌量不大于100cfu。

—取 的供试液9.9ml和小于10000cfu的铜绿假单胞菌菌悬液0.1ml混匀后,吸取1ml注入平皿中,立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基 15~20ml,混匀,凝固,于30~35℃倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。

—取 的供试液9.9ml和小于10000cfu的金黄色葡萄球菌菌悬液0.1ml混匀后,吸取1ml注入平皿中,立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15~20ml,混匀,凝固,于30~35℃倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。

—取 的供试液9.9ml和小于10000cfu的枯草芽孢杆菌菌悬液0.1ml混匀后,吸取1ml注入平皿中,立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15~20ml,混匀,凝固,于30~35℃倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。

—取 的供试液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌悬液0.1ml混匀后,吸取1ml注入平皿中,立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15~20ml,混匀,凝固,于30~35℃倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。

—取 的供试液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌悬液0.1ml混匀后,吸取1ml注入平皿中,立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15~20ml,混匀,凝固,于30~35℃倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。

—取 的供试液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌悬液0.1ml混匀后,吸取1ml注入平皿中,立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15~20ml,混匀,凝固,于20~25℃倒置培养5天点计菌落数。平行制备2个平皿。

—取 的供试液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌悬液0.1ml混匀后,吸取1ml注入平皿中,立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15~20ml,混匀,凝固,于20~

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25℃倒置培养5天点计菌落数。平行制备2个平皿。 3.1.2.菌液组

—取小于100cfu的铜绿假单胞菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液各1ml,注入平皿中,立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基约15~20ml,混匀,凝固,于30~35℃倒置培养3天点计菌落数。各平行制备2个平皿。

—取小于100cfu的白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液各1ml,立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基各15~20ml,混匀,凝固,于20~25℃倒置培养5天点计菌落数。各平行制备2个平皿。 3.1.3.供试品对照组

—取 的供试液1ml,注入平皿中,分别立即倾注15~20 ml温度不超过45℃胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基,混匀,凝固,胰酪大豆胨琼脂培养基30~35℃倒置培养3天点计菌落数,沙氏葡萄糖琼脂培养基20~25℃倒置培养5天点计菌落数。各组平行制备2个平皿。 3.1.4.结果判断

3.1.4.1计算公式:

稀释剂对照组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数

稀释剂对照组菌数的回收率=

菌液组的平均菌落数

试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数

试验组菌数的回收率=

菌液组的平均菌落数

3.1.4.2判定标准:

实验组、稀释剂对照组(如有)的菌数回收率应在0.5~2之间。若各试验菌的回

率均符合规定,照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、 霉菌和酵母菌总数计数。 3.1.5试验结果

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供试品批号 、 、 。

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