安徽医科大学第一附属医院检验科
作业指导书 文件编号: AYL-S7-337 版本:3.0 页码: 第1页 共4页 编写者：沈继录 文件发放范围：微生物组 审核者： 批准人： 生效日期：2012.1.1 文件年度审核 审核者： 日期： 审核者： 日期： 审核者： 日期： 审核者： 日期： 血液及骨髓标本细菌学检验标准操作规程
1．目的
规范血液及骨髓标本细菌学检验标准操作规程，确保检验结果准确可靠。
2．适用范围 血液及骨髓。 3．标本
3.1 标本类型 血液及骨髓。 3.2 标本采集
3.2.1 采血时间 抗菌药物治疗前，发热初期或高峰时抽血。
3.2.2 采血频率 对怀疑菌血症的成年病人，推荐同时在不同部位采集2～3套(每套包括一瓶需氧瓶、一瓶厌氧瓶或者两套需氧瓶)，对感染性心内膜炎和真菌血症则应多次采集；婴幼儿病人，推荐同时在不同部位采集2套，可不做厌氧培养。
3.2.3 采血量 以培养基的1／10为宜，成人一次采血5～10 ml，婴幼儿为1～2 m1。
3.2.4 骨髓标本 用骨髓穿刺针从髂骨采集。 3.3标本拒收标准
3 3．1血培养瓶破裂或有明显污染。 3 3 2 培养瓶标识与化验申请单不符。
3．3 3用过期的培养瓶采集标本、采血量不足等。
3.3.4 对于不合格标本，应及时通知采集人员重新留取标本。
3.4 标本保存 采集标本后立即送到实验室，不能及时送检可置室温，切勿放冰箱。冬季血培养瓶在送检过程中应采取一定的保暖措施。
4．试剂、仪器
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作业指导书 文件编号: AYL-S7-337 版本:3.0 页码: 第2页 共4页 4.1 革兰染液、氧化酶试剂、3％过氧化氢、血琼脂平板、巧克力平板、麦康凯平板、相关生化试剂等。
4.2 BACT／Alert 3D或BACTEC 9000全自动血培养系统、VITEK鉴定系统。成人需氧血培养瓶、厌氧血培养瓶、儿童血培养瓶、革兰阴性菌鉴定卡(GNI+)、革兰阴性菌药敏卡((GNS)、革兰阳性菌鉴定卡(GPI)、革兰阳性菌药敏卡(GPS)、真菌鉴定卡(YBC)、药敏纸片、ATB板条等。
4.3 接种针、接种环、电热灼烧器、显微镜、孵育箱、C02培养箱等。 4.4 试剂的有效期和使用参照试剂说明书。 5．细菌鉴定和药敏质控 参见《质量管理程序》。 6．检验步骤
接收标本后，立即对标本进行编号、登记。门诊病人要同时登记住址，联系电话等病人信息。
6.1自动化培养 将血培养瓶置全自动血培养仪中。当标本有菌生长时，仪器发出阳性报警，应立即用无菌注射器抽取瓶内培养液作直接涂片革兰染色，镜检，将结果向临床医师报告，同时转种血琼脂平板、麦康凯平板（或中国蓝平板）或加做巧克力平板，并进行直接药敏试验，置35℃、5％C02培养箱培养18～24小时。从琼脂平板上挑取菌落进行涂片染色及触酶和氧化酶试验。革兰阳性菌和革兰阴性菌分别选用GPI及GNI上机进行细菌鉴定和药敏试验或者做K—B法药敏试验(具体操作见《药物敏感性标准操作规程》)。
6.2手工培养
6.2.1将血培养瓶置35℃孵育箱，经18～20小时孵育在血琼脂平板或巧克力平板上盲目转种一次。
6.2.2盲目转种后，培养瓶继续孵育至第5日，每日观察一次有无菌生长，并摇匀继续培养，下列几种情况提示有细菌生长(表5—28)。
表5—28培养瓶中有细菌生长时的不同反应
根据肉眼观察，对有细菌生长迹象，取菌悬液涂片作革兰染色，同时分离培养，接种需氧血琼脂平板、麦康凯平板（或中国蓝平板）或加做巧克力平板，并进行直接药敏
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作业指导书 文件编号: AYL-S7-337 版本:3.0 页码: 第3页 共4页 试验，置35℃、5％CO2培养箱培养18～24小时。次日纯培养再进行鉴定及药敏试验。
6 3特殊培养
6.3 1布鲁菌属 通常将血液接种到双相血培养瓶内，培养环境应为5％～10％CO2，35℃，每48小时观察有无细菌生长，若无细菌生长应继续培养，阴性应培养至30日后才可发出报告。
6.3.2乏养菌 该细菌生长需要巯醇复合物和维生素B6。在血培养基中需加盐酸一磷酸吡多醛(0．001％)或L-半胱氨酸 (O.05％～O.1％)或两者皆有，否则乏养菌不能生长。血培养物转种血琼脂平板上，然后交叉划线接种金黄色葡萄球菌，靠近金黄色葡萄球菌有乏养菌生长。
6.3.3 L型细菌 在培养基中含有10％蔗糖或甘露醇时，才适合L型细菌生长。 6.3.4 心内膜炎特殊致病菌 如果常规血培养72小时阴性而病人临床症状仍提示感染性心内膜炎，应提高培养基的营养或补加添加剂。有利于分离营养要求苛刻、生长缓慢的革兰阴性杆菌，如人心杆菌、侵蚀艾肯菌、金氏菌、伴放线杆菌、军团菌等细菌，应延长培养至2～4周，然后转种特殊的培养基。 、
6.3.5 结核分枝杆菌培养 参见《分枝杆菌属检验标准操作规程》。
7．操作流程
血液、骨髓
置血培养仪 需氧培养 厌氧培养