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CRISPR/Cas9-based genome editing technology
A robust CRISPR/Cas9 vector system for multiplex targeting of genomic sites in monocot and dicot plants
亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室
华南农业大学生命科学学院
刘耀光课题组
(ygliu@scau.edu.cn)
1. pYLCRISPR/Cas9多靶点载体介绍
CRISPR/Cas9是新近发展的基因组编辑技术（图1）。CRISPR/Cas9切割靶序列仅需要single-guide RNA (sgRNA)以及由sgRNA引导的Cas9蛋白，比锌指核酸酶（ZFNs），TALENs更加简便，高效，因而成为基因组编辑工具的首选。
我们利用CRISPR/Cas9技术可方便地进行多重靶向的特征，构建了一套用于单子叶和双子叶植物的多靶点CRISPR/Cas9基因打靶载体系统。
本套载体将Cas9蛋白表达盒整合到双元载体上，用于装载多个sgRNA表达盒的多克隆位点Bsa I位于靠近双元载体RB位置。sgRNA表达盒元件设在中间质粒载体上，利用酶切连接和PCR方法拼装好，再利用Golden Gate或Gibson Assembly克隆方法组装到双元载体上。
Cas9 nucleaseRuvC-like domainHNH domainTarget Site PAMNGGNNNNNNNNNNNN-3’genome NCCNNNNNNNNNNNN-5’sequenceAA5’ NNNNNNNNNNNN3’ NNNNNNNNNNNNGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCleavage siteNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN5’-G/ANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAACUAUUGCCUGAUCGGAAUAAAAUUCGAUAGAAFigure 1. A working model of the CRISPR/Cas9 system. The Cas9-sgRNA complex locates to the target site to cleave the DNA to produce double strand break (DSB).
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CUUGAAAAAGUGGCACCGAUUUUU-3’GCGUGGCU
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2．CRISPR/Cas9载体与sgRNA载体图谱
2.1CRISPR/Cas9双元载体
本套载体系统的双元载体骨架为pCAMBIA-1300 (ACCESSION: AF234296)，Cas9p为本实验室设计合成的植物优化密码子基因，它模拟了禾本科植物基因具有5’端GC含量较高的特征 (Figure 2)。
这些质粒在E. coli TOP10F’(LacI) 菌株繁殖，该菌株LacI基因型产生的阻碍蛋白可抑制ccdB大肠杆菌致死基因的表达。
pYLCRISPR/Cas9Pubi-H, -B载体中的Cas9p用pUbi驱动，优选用于单子叶植物的基因打靶；对于双子叶植物，目前优先使用pYLCRISPR/Cas9P35S-H, -N,-B。我们用pYLCRISPR/Cas9Pubi-H在拟南芥也打靶成功，但与pYLCRISPR/Cas9P35S-H对拟南芥的打靶效率比较正在测试中。
我们对pYLCRISPR/Cas9载体采用了新的命名，与旧的命名对应关系见表1。
Figure 2. A CRISPR/Cas9 system for monocot and dicot plants. pYLCRISPR/Cas9Pubi-H, -B (above); pYLCRISPR/Cas9P35S-H, -N,-B (below);
q
q
HPT (-H), Bar (-B), and NPT II (-N)
encode hygromycin B phosphotransferase, PPT acetyltransferase and neomycin phosphotransferase II, respectively. NLS, nuclear localization sequence. The key sequences including restriction sites for cloning and analysis of sgRNA expression cassettes are given. Two Bsa I-cutting sties [Bsa I (B-L) and Bsa I (B-R)] for cloning the sgRNA expression cassettes are separated by a shorten form of the ccdB negative selection gene. .
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表一 pYLCRISPR/Cas9载体新旧命名对应关系 新命名
pYLCRISPR/Cas9Pubi-H
原命名
pYLCRISPR/Cas9-MH, pYLCRISPR/Cas9-MTmono
pYLCRISPR/Cas9Pubi-B pYLCRISPR/Cas9P35S-H pYLCRISPR/Cas9P35S-B pYLCRISPR/Cas9P35S-N
pYLCRISPR/Cas9-MB pYLCRISPR/Cas9-DH pYLCRISPR/Cas9-DB pYLCRISPR/Cas9-DN
单子叶/双子叶 双子叶 双子叶 双子叶
草甘磷 潮霉素 草甘磷 卡那霉素
适用植物种 单子叶/双子叶
植物抗性 潮霉素
2.2 CRISPR/sgRNA vectors
sgRNA序列全长96 nt，分为两部分，5’决定靶序列的20碱基 (seed sequence)和3’区域为保守的结构序列。因此构建针对特定靶位点的sgRNA，只需要克隆决定靶序列的5’端20 nt (seed sequence)。 sgRNA用small nuclear (sn) RNA U6/U3启动子驱动，以保证转录出的sgRNA停留在细胞核中与Cas9结合。
本方案用PCR扩增的方法构建包含靶序列的sgRNA表达盒，并在扩增引物5’端引入顺次排列的位置特异Bsa I 酶切位点，用于Golden Gate克隆。或在扩增引物5’端加入互补序列用于Gibson Assembly 连接克隆。
为了提高构建好的多靶点载体的稳定性，避免在农杆菌或者植物基因组中sgRNA表达盒之间发生同源重组，从水稻克隆了4个不同snRNA启动子(OsU3,OsU6a，OsU6b，OsU6c)，用于单子叶植物；从拟南芥中克隆了4个不同snRNA启动子（AtU3b，AtU3d，AtU6-1，AtU6-29），用于双子叶植物。
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