高效液相色谱法
思考题和习题
1． 简述高效液相色谱法和气相色谱法的主要异同点。
相同点：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼具分离和分析功能，均可以在线检测 不同点： 分析对象及范围 流动相的选择 操作条件 加温常压操作 流动相为有限的几种能气化、热稳定性好、且沸“惰性”气体，只起运载作点较低的样品，占有机物的20% 用，对组分作用小 GC 溶解后能制成溶液的样品，流动相为液体或各种液高沸点、高分子量、难气化、离体的混合。它除了起运载作用HPLC 子型的稳定或不稳定化合物，占外，还可通过溶剂来控制和改有机物的80% 进分离。 室温、高压下进行 2．离子色谱法、反相离子对色谱法与离子抑制色谱法的原理及应用范围有何区别？
离子色谱法(Ion Chromatography) ：用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。以电导检测器为通用检测器。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法，也可用于阳离子分析。
反相离子对色谱法(IPC或PIC) ：反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离。适用于较强的有机酸、碱。
反相离子抑制色谱：在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制组分解离，增加其k和tR，以达到改善分离的目的。适用于极弱酸碱物质（pH=3~7弱酸；pH=7~8弱碱；两性化合物） 3．速率理论方程式在HPLC中与在GC中有何异同？如何指导HPLC实验条件的选择？
解:液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素为涡流扩散、流动的流动相传质、滞留的流动相传质以及柱外效应。
在气相色谱中径向扩散往往比较显著，而液相色谱中径向扩散的影响较弱，往往可以忽略。另外，在液相色谱中还存在比较显著的滞留流动相传质及柱外效应。
在高效液相色谱中，对液液分配色谱，Van Deemter方程的完整表达形式为
由此，HPLC的实验条件应该是：①小粒度、均匀的球形化学键合相；②低粘度流动相，流速不宜过快；③柱温适当。
4．试讨论影响HPLC分离度的各种因素，如何提高分离度？
(1) 色谱填充性能
液相色谱柱分离性能的优劣，是由固定相粒度、柱长、由柱内径和填充状况决定的柱压降这三个参数度决定的。这三个参数度也决定了样品组分的保留时间，保留时间不仅与色谱过程的热力学因素k有关，还直接与决定柱效与分离度的柱性能参数及流动相的黏度有关，这些参数都是影响色谱分离过程动力学的重要因素。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般都是购买商品柱，很少自行制备。
(2) 流动相及流动相的极性
液相色谱中，改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接因素。液相色谱不可能通过增加柱温来改善传质。因此大多是恒温分析。流动相选择在液相色谱中显得特别重要，流动相可显著改变组分分离状况。
(3) 流速
流速大于0.5 cm/s时， H～u曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。 5．指出苯、萘、蒽在反相色谱中的洗脱顺序并说明原因。
三者极性顺序从大到小是苯、萘、蒽，因此在反相色谱中的洗脱顺序为苯、萘、蒽，苯最先出峰。 6．宜用何种HPLC方法分离下列物质？
2+2+
（1）乙醇和丁醇；（2）Ba和Sr；（3）正戊酸和正丁酸；（4）相对分子质量的的葡糖苷。
1
（1）正相键合相色谱法 （2）离子交换色谱法 （3）离子对色谱法 （4）空间排阻色谱法
7．外标法测定黄芩颗粒中的黄芩苷的质量分数。 8．内标校正因子法计算炔诺酮和炔雌醇的质量分数。
9．测定生物碱试样中黄连碱和小檗碱的含量，称取内标物、黄连碱和小檗碱对照品各0.2000g配成混合溶液。
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测得峰面积分别为3.60×10, 3.43×10和4.04×10?V·s。称取0.2400g内标物和试样0.8560g同法配制成溶
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液后，在相同色谱条件下测得峰面积为4.16×10, 3.71×10和4.54×10?V·s。计算试样中黄连碱和小檗碱的质量分数。
（黄连碱26.2%，小檗碱27.3%）
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tR2=4.45min。10．用15cm长的ODS柱分离两个组分。柱效n=2.84×10m；测得t0=1.31min；组分的tR1?4.10min；
(1)求k1、k2、α、R值。(2)若增加柱长至30cm，分离度R可否达1.5?
((1)k1=2.13、k2=2.40、α=1.13、R=1.33，(2)R=1.88，能)
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