使用Oligo 6和Primer Premier 5.0等软件设计PCR引物
张新宇
（中国医科院肿瘤研究所，北京100021） 电子邮件: zhangxy@pubem.cicams.ac.cn
在当今分子生物学研究中，PCR技术已成为使用最多，最广泛的技术之一。而引物设计是PCR技术中至关重要的一环。在PCR扩增以前，一般模板序列已被全部或部分确定。要想扩增出理想的目的片断，一般都得通过正确设计PCR引物。也有的人不经过设计直接取模板序列的两个片断作为引物，这样很可能导致实验失败，如扩增出多条带（引发错配所致），不出目的带或出目的带很弱（引物引发效率低下），引物二聚体带（引物与引物之间形成稳定二聚体）等等。 现在PCR引物设计都通过计算机软件进行。生物信息学发展至今日，具有引物设计功能的软件有很多，其中大部分是免费软件，可直接从网上下载，安装并运行。这类软件大都简单易用，但其引物设计功能一般不很强，通过它们设计的引物常常不尽如人意，而专门进行引物设计的商业版软件功能强大，但使用起来不太容易。本文就这一问题进行探讨。
引物设计的原则
引物设计有几条基本原则：
首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应(即错配)。
围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm值 (melting temperature)，ΔG值(internal stability)，引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin），错误引发位点（false priming site），引物及产物GC含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。以使用Oligo软件分析设计引物为例，笔者总结出以下的要点：
1. 引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延
伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度。
2. 引物3’端的序列要比5’端重要。引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点
的引发效率相对比较高。另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
3. 引物的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含
量不能相差太大。
4. 引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃左右。
5. ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈
正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。 6. 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引
发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，如此可保证不出非目的产物的假带。 7. 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降
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低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3’端的连续GGG或CCC会导致错误引发。 8. 对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游
引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。 值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件较差，比如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；有时PCR产物要作为克隆对象插入到载体中表达，因此PCR引物设计的可选择度很低。遇到这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件，这时，使用自动搜索引物及正确地评价引物可使研究人员对实验心中有数。
引物的自动搜索和评价分析
带有引物设计功能的软件有很多，大都是For Windows版本的。在此特别推荐两个专门性的引物设计软件（商业版）：Primer Premier 5（以下简称Premier） 和 Oligo 5.0/6.22
软件的引物设计功能主要体现在两个方面，首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以Oligo 软件最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索功能以Premier 为最强且方便易用，Oligo软件其次，其他软件如Vector NTI Suit, Dnasis, Omiga, Dnastar都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。当然要想保证得到效果理想的引物，在自动搜索的基础上，还要对引物辅以人工分析，以得到最佳设计的引物。因此，笔者认为引物设计软件的最佳搭配是Oligo 和Premier 软件一起，以Premier进行自动搜索，Oligo进行分析评价，如此可设计出成功率很高的引物。笔者曾以此搭配给多人设计引物，速度又快效果又好。
Primer Premier 5.0的使用技巧
1.功能简介
Premier的主要功能分四大块，其中有三种功能较常用，即引物设计(酶切点分析(
)，基元查找(
)。另个功能是同源性分析（
)，限制），并
非Premier的特长，在此略过。该软件还有别的一些功能，如序列”朗读”，DNA与蛋白序列的互换（
），发声提示键盘输入（
）等，但其中最优秀的却是能设计简并
引物。
简并引物的出现是出于遗传密码的简并性。有时需要根据一段氨基酸的保守序列反推到DNA水平设计引物。众所周知，大多数氨基酸（二十种常见结构氨基酸中的十八种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA序列时，就遇到部分碱基的不确定性。这种不确定性因物种或细胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的，甚至植物线粒体与无脊椎动物线粒体以及无脊椎动物线粒体的遗传密码都不尽相同。Premier可以针对各种不同的遗传密码规律设定不同的DNA和氨基酸的相互转换，这取决于被分析序列的出处。这样设计出来的引物实际上是多种序列的混和物，在某些位点有所变化，但大部分还是相同的，称之为简并引物。Primier软件给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear），无脊椎动物线粒体（Invertebrate
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Mitochondrion），支原体（Mycoplasma），植物线粒体（Plant Mitochondrion），原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion），一般标准（Standard），脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion），和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）。
2. 使用步骤及技巧
Premier软件的起动并打开一段序列后，界面如下：
其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。限制酶切点分析及基元查找功能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制酶或基元（如-10序列，-35序列等），按确定即可。常见的限制酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新限制酶或基元。
进行引物设计时，点击
按钮，界面如下：
进一步点击
按钮，出现search criteria窗口，有多种参数以调整。搜索目的
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（Seach For）有三种选项，PCR引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers），杂交探针（Hybridization Probes）。搜索类型(Search Type)可选择上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer）都分别查找(Both)，或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible With Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search Ranges），引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）等等。研究人员可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然后按
，随之出现的Search Progress窗口中显示Search Completed时，再按
，
这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分为100，即各指标都能达标（如下图）。
点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示Peimer Premier主窗口，如图所示：
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该图分三部分，最上面是图示PCR模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由
变成
，点击该按钮，在左下角的窗
口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有
，只有
。值得注意的是中间一栏的末尾给出
该引物的最佳退火温度，可参考应用。
有时需要对引物进行修饰编辑，如在5’端加入限制酶切点，可点击改引物序列。若要回到搜索结果中，则点击
按钮。
，然后修
若要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则，反推至DNA序列即可。当然，对简并引物的分析不能象一般引物那样严格。
总之，Premier有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，使用也容易上手，是一个相当不错的软件。
Oligo 6.22使用技巧
1. 功能简介
在专门的引物设计软件中，Oligo是最大名鼎鼎的。Oligo的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0的初始界面是两个图：Tm图和ΔG图；Oligo 6.22的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq图，不知底细的人当然一看就蒙了。其实Oligo的主要功能集中在Analyze菜单里，只要把它弄懂了，其他的就很简单了。
Oligo的功能比Premier还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。Oligo 6.22比Oligo 5.0的改进有，多序列共用引物设计，排除出现频率高的
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