酶动力学综合实验
实验（一）——碱性磷酸酶Km值的测定
【目的要求】
1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响
2.了解米氏方程、Km值的物理意义及双倒数作图求Km值的方法。 【实验原理】 1、碱性磷酸酶：
碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多。其次为肾脏、骨骼、肠和胎盘等组织。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。本实验用的碱性磷酸酶是从大肠杆菌中提取的。 2、米氏方程：
Michaelis-Menten 在研究底物浓度与酶促反应速度的定量关系时，导出了酶促反应动力学的基本公式，即：
错误！未找到引用源。 (1)
式中：v表示酶促反应速度，
错误！未找到引用源。表示酶促反应最大速度， [S]表示底物浓度，
错误！未找到引用源。表示米氏常数。
3、 错误！未找到引用源。值的测定主要采用图解法，有以下四种： ①双曲线作图法（图1-1，a） 根据公式（1），以v对[s]作图，此时1/2错误！未找到引用源。时的底物浓度[s]值即为Km值，以克分子浓度（M）表示。这种方法实际上很少采用，因为在实验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和。实测错误！未找到引用源。一个近似值，因而1/2错误！未找到引用源。不精确。此外由于v对[S]的关系呈双曲线，实验数据要求较多，且不易绘制。
② Lineweaver- Burk作图法双倒数作图法（图1-1，b） 实际工作中，常将米氏方程（式（1））作数学变换，使之成为直线形式，测定要方便、精确得多。其中之一即取（1）式的倒数，变换为Lineweaver- Burk方程式：
错误！未找到引用源。 (2)
以错误！未找到引用源。对错误！未找到引用源。作图，即为y=ax+b形式。此时斜率为错误！未找到引用源。，纵截距为错误！未找到引用源。。把直线外推与横轴相交，其截距相交，其截距即为—错误！未找到引用源。。 ③Hofstee作图法（略）
把（2）式等号两边乘以错误！未找到引用源。，得：
错误！未找到引用源。 (3)
以v对错误！未找到引用源。作图，这时斜率为错误！未找到引用源。，纵截距
为错误！未找到引用源。，横截距为错误！未找到引用源。。 ④Hanas作图法（略）
把（2）式等号两边乘以[S],得：
错误！未找到引用源。 (4) 以
对[s]作图，这时斜率为错误！未找到引用源。，纵截距为错误！未找到引用
源。。
（a） (b)
本实验主要以双倒数法，即Lineweaver- Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。具体原理如下：
本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸，在适宜条件下（PH10.0，和60℃），准确反应13分钟。在碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物，以波长620nm比色。在一定条件下色泽深浅与光密度成正比。反应式如下：
然后以光密度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度，即以光密度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver- Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。
【仪器与试剂】 仪器：
1. 恒温水浴
2. 721型分光光度计
试剂：
1． 酚试剂：称钨酸钠（错误！未找到引用源。W错误！未找到引用源。·2错误！未找到引用源。O）100g，钼酸钠（错误！未找到引用源。Mo错误！未找到引用源。·2错误！未找到引用源。O）25g置1500mL磨口回流装置内，加蒸馏水700mL，85%磷酸50mL和浓硫酸100mL。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水50mL及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至1000mL，过滤即成，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。使用时用蒸馏水稀释一倍，最后酸度为1N。
2． 2.5mM磷酸苯二钠基质液：称取625mg磷酸苯二钠（C6H5PO4Na2?2H2O），溶于1,000ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，加数滴夜溴以防腐，置冰箱内可保存一年之久。 3． 碱性缓冲液（pH10.0）： 称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g，溶解于蒸馏水中，并稀释至1,000ml.
4． 碱性磷酸酶液：称取碱性磷酸酶1mg,加水3~4ml，冰箱内可保存五周左右。 【实验步骤】
取6支试管按下表加入试剂： 1 2 3 4 5 6 2.5mM磷酸苯二0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 钠（ml） 蒸馏水（ml） 0.8 0.6 0.4 0.2 - 0.1 碱性缓冲液1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 （ml） 混匀后，60℃欲温5分钟 碱性磷酸酶液0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 - （ml） 混匀后，60℃水浴13分钟（准确计时） 注意：1）加入碱性磷酸酶液要快速、准确。用移液枪加 2）此时为酶促反应，总体积2.1ml 3）第六管不加酶。 酚试剂（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 10%Na2CO3(ml3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 ) 混匀后，室温放置15分钟 注意：1）酚试剂为显色剂，同时为酶的变性剂，故加入酚试 剂后酶促反应即停止。 2）Na2CO3 提供碱性环境，加入Na2CO3 后试剂才显色 以6管为调零点，在620nm波长处比色。 【结果处理】
1 将各管光密度和底物浓度记入下表 管号 O.D 1/O.D [S] 1/[S] 1