枯草芽孢杆菌的10L发酵罐分批发酵
一、 实验目的：
通过实验加深对发酵罐结构和分批发酵原理的认识，了解工业发酵的基本原理和方法。 二、 实验原理：
（一） 发酵罐的结构组成原理 （二） 分批发酵的原理
分批发酵是一种准封闭式系统，种子接种到培养基后除了气体流通外发酵液始终留在生物反应器内，在此简单系统内所有液体的流量等于零。分批发酵过程一般可以粗分为四期：停滞期、对数生长期、稳定期和衰退期。
停滞期，即刚接种后的一段时间，细胞数目和菌量不变，因菌对新的生长环境又一适应过程，其长短主要取决于种子的活性、接种量和培养基的可利用性和浓度。
当细菌已经适应新的环境，养料充足而又无抑制生长的物质，便进入对数生长期，其比生长速率达到最大。
随着养料的减少，有害代谢产物的积累，生长不可能再无限制地继续。此时比生长速率为养分、代谢产物和时间的函数，其细胞量仍在增加，但其比生长速率不断下降，细胞在代谢与形态方面逐渐退化，经短时间的减速后进入稳定期，此时净生长速率为零。
当养分耗竭，对生长有害代谢物在发酵液中大量积累便进入死亡期，此时生长呈负增长。工业发酵一般不会等到菌体开始自溶时结束培养。
三、 实验材料与设备
（一）材料
1、 菌种：枯草芽孢杆菌 2、 培养基
种子培养基：液态LB培养基
发酵培养基：糖蜜10g/L，鱼粉10g/L，Nacl2.5g/L，CaCl21g/L，MgSO4·7H2O1.25g/L，KH2PO4 为0.38g/L，K2HPO40.74g，麦麸为5.20 g/L，玉米粉为6.49 g/L。 （二）设备：镇江东方生工10L发酵罐 四、 实验步骤
1. 菌种的准备：取冷冻甘油种接种到平皿中，在平皿中挑取单菌落接到试管斜面。三角瓶
液体培养基摇床振荡培养。 2. 发酵液的准备：
先取鱼粉40g，麦麸20.8g, 玉米粉25.96g 加热至沸腾然后加入糖蜜40g 过滤培养基然后加入Nacl 10g， CaCl2 4g，MgSO4·7H2O 5g，KH2PO4 为1.52g，K2HPO40.74g为2.96g。定容至3400ml(实消时会产生15%的冷凝水) 3. 启动发酵罐
打开空气压缩机电源，按start键；检查蒸汽发生器水箱水位，打开电源开关；检查发
酵罐水箱水位。
4. 发酵罐空消及空气管道消毒
待压缩空气压力和蒸汽压力不再上升时，进行过滤器及管道消毒、空消。 ⑴关V134、V135、开V137、V125，排出夹套中的冷凝水，关V125。
⑵开V126、V152，排尽蒸汽管中冷凝水后将V152转为微开；开V151，微开V106，调节使罐内升压至0.11MPa。
⑶关V101，开V121，开V104，排尽冷凝水，将V104调为微开，开V103，关V151，维持罐压0.11MPa 30min。注意V101一定要关死，防止蒸汽进入流量计使其损坏。
⑷关V121，待罐压和过滤器压力降到0.05左右打开V101，开V104排出冷凝水。微开V104，调节V103和V106使空气流量保持在6-9之间，罐压保持在0.05MPa。
⑸关V137，开V135、V134，冷却夹套。注意，冷却过程中一定要随时注意调节V103使罐内压力保持在0.05MPa。防止温度突降造成罐内负压损坏设备。 ⑹待温度降到50摄氏度时，关V134、V135。 5. 发酵罐加培养基实消
⑴关V103，开V106，待罐内压力降为零，安装校正好的溶氧电极和pH电极，从加料口加入培养基。
⑵关V134、V135、开V137、V125，排出夹套中的冷凝水，将罐内温度加热至80-90摄氏度（整个过程中要搅拌），关V125、V137。
⑶开V126、V152，排尽蒸汽管中冷凝水后将V152转为V152转为微开；开V151，微开V106，调节使罐内升压至0.11MPa，保持30min。 ⑷关V151、V152、V126、V106。
⑸关V137，开V135、V134，冷却夹套。待温度降至80摄氏度，开V103、V106，调节使使空气流量保持在6-9之间，罐压保持在0.05MPa， 6. 接种培养
待温度降到37摄氏度时接种。
⑴用酒精棉擦洗接种口，并在接种口四周围上酒精棉。
⑵调节V103和V106是罐压保持在0以上（注意不能为0，防止污染）。点燃酒精棉，拧开接种口，接种（注意无菌操作），盖上接种口，用湿毛巾灭火。
⑶调节V103、V106，达到工艺要求的通气量并保持罐压，打开控制柜设置各种参数培养。 7. 取样检测
⑴开V126，微开V152，保持15min，关V126、V152。
⑵开V151、V152放出少量培养液，关V152、V151。注意无菌操作，在酒精棉的火焰下进行。测培养液的还原糖含量、总糖含量，氨氮含量，菌体数量。 ⑶取样口灭菌，同⑴条。 8. 出料
培养完毕，打开V151、V152放出培养液。 9. 发酵罐的清洗
⑴加入自来水，通气搅拌，放净罐内水。
⑵如很脏，则关闭电源，旋下电机及各传感器的连线插头。对称拧下罐盖螺母，移走罐盖，加入适量水，用软毛刷刷洗，放净罐内水。再装上罐盖。
四、撰写实验报告，根据发酵数据绘出发酵曲线图并分析（温度、PH值、OD值、DO值四个曲线图并分析原因）。
附： 发酵罐使用注意事项
一、 开蒸汽发生器时首先检查有没有水；另外要等到有压力时才能
使用蒸汽、
二、 空气精过滤器消毒时，蒸汽阀门上方的空气阀门一定要关死，
防止蒸汽进入流量计使其损坏。
三、 打开罐子上任意一个接口时压力需要降到零；罐子降温时一定
要保持内部正压。
四、 发酵罐的水箱确保有水。 五、 过滤器消完毒后压力不能降为零。
六、 控制柜的温度校正和电机转速比不能更改；电脑软件上的串口
不能改。
七、 温度降到50摄氏度以下才能向里面投料。
八、 左边供给发酵罐的自来水龙头在确保有水的情况下应开的尽
量小。