利用实时荧光定量ＰＣＲ法检测转基因水稻外源基因拷贝数的研究
摘 要：转基因植物中外源基因拷贝数是影响目的基因表达水平和遗传稳定性的重要因素，因此外源基因拷贝数的检测成为转基因研究的关键，利用高通量、快速、灵敏的SYBR Grcen I荧光定量实时PCR法，检测了转大麦烟酰胺合成酶基因(NAS1)水稻中外源基因拷贝数，以蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)作为水稻的内源参照基因，通过梯度稀释法，分别获得了NA51和SPS基因的Ct值与起始模板数的相关性标准曲线，相关系数分别为0.99976和0.99571，相关性高，通过目的基因NASl和水稻內源参照基因SPS起始模板数的比较，获得了目的基因在转基因水稻中的拷贝数，在8株转基因株系中，1株为假阳性，1株拷贝数为1，3株拷贝数为2，其余3株拷贝数分别为3、4和7，而阴性对照拷贝数为0，这种方法快速、简便、准确，可以满足转基因育种工作中对后代优良株系的选择。
关键词：SYBR Creen I实时荧光定量PCR；烟酰胺合成酶基因；转基因水稻；拷贝数
植物遗传转化是作物改良和新基因功能鉴定的常用方法，但在转基因植物中外源基因拷贝数常影响目的基因的表达水平和遗传稳定性，因此，转基因研究中关键的一步就是检测外源基因的拷贝数，以筛选出拷贝数少或单拷贝的转基因植株供进一步的研究或育种利用，传统的转基因植株拷贝数检测主要是Southern杂交法，但该方法工作量大，需要的DNA材料较多，费时费力，并且经常要用到放射性同位素等具有潜在危险的药品，近年来，利用高通量、快速、灵敏的定量PCR方法检测转基因拷贝数逐渐受到科研人员的青睐。
SYBR Green I实时荧光定量PCR法是在PCR反应体系中加入SYBR Green I荧光染料，该染料能够结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域并具有受激发产生绿色荧光的能力，当它与PCR合成的双链DNA结合，在激发光照射下产生荧光，由于荧光信号强度的增加与PCR产物的增加完全同步，因此通过对PCR反应进程中的荧光信号强度进行实时检测，就可间接的获得PCR扩增数据，根据Ct(cycle thresholds)值与起始模板数的对数值成反比线性关系的原理，制作标准曲线，获得Ct值与起始模板数的相关性方程，将样品的Ct值代人该方程就可获得目的基因的起始模板数，通过与水稻内源参照基因起始模板数的比较，就可知道基因组中该外源基因拷贝数，内源参照基因一般选择拷贝数少，同一物种内的不同生态类型间具有稳定的序列结构和拷贝数的一类基因，Ding等通过对水稻、小麦、玉米、大麦等十几种作物的研究发现，蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase，SPS)基因是水稻特有的基因，并且为单拷贝，可以作为水稻的内源参照基因。
本研究利用根癌农杆菌介导法获得的转大麦烟酰胺合成酶基因(NAs1)的水稻为材料，选择蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)作为内源参照基因进行拷贝数估算，通过SYBR Green I实时荧光定量PCR法检测转基因植株中NASl基因的拷贝数。
1 材料与方法
1．1 材料
水稻材料：非转基因水稻台北309；转NAS1基因的台北309当代植株。
质粒载体：p0390-MF-NASl，中科院遗传所储成才研究员协议提供，含有NAS1基因，编码产物为烟酰胺合成酶。
试剂：大连宝生物工程有限公司生产的SYBR Premix Ex TaqTMM(Code N0：DRR041S)。
1．2 方法 1．2 1 DNA的提取 水稻基因组DNA采用SDS法提取，用BioPhotometer分光光度计(Eppendorf公司)检测DNA含量及纯度。
1．2．2 引物
NAS1基因引物用primer express设计，SPS基因引物参照杨立桃等文中序列(见表1)，均由上海生物工程有限公司合成，退火温度为60℃。
1．2．3 PCR反应体系和程序
定量PCR反应体系：SYBR Premix Ex TaqTM(2×)10μL，PCR上游引物(10μmol/L)0.4μL，PCR下游引物(10μmol/L)0.4μL，DNA模板(1.5mg／L)2.0μL，灭菌蒸馏水7.2μL，总体积20μL。
PCR反应程序为(本实验采用两步法PCR扩增程序)：预变性，95℃10s，循环数1；PCR反应，第一步，95℃变性10s；第二步，60℃退火延伸45s，同时在退火过程中检测荧光信号变化，共进行45个循环，荧光定量PCR仪为Rotor-gene3000 Real Time Thcmlal Cycler(Corbett Research，Australia)。
1．2．4 NAsl基因和SPS基因标准曲线的制作
本实验中DNA浓度的测定采用BioPhotometer分光光度计(Eppendorf)，定量PCR结果采用软件Rotor-gene-6-0-19分析。
NAsl基因标准曲线的制作是将带有目的基因的质粒DNA做10、102、103、104倍稀释，并以这些稀释的DNA为模板进行PCR反应，得到各自的Ct，通过
Ct值与起始模板数的对数值之间存在的线性关系，获得标准曲线，SPS基因标准曲线的制作是将水稻基因组DNA做10、 10×2、102、102×2、103的梯度稀释，用与NAS1同样的方法获得标准曲线。
2 结果与分析
2．1 标准曲线的制作
NAsl和SPS基因的扩增曲线如图1和图2所示，标准曲线如图3和图4所示，NAsl标准曲线的相关系数及=0.99976，相关性高，该基因Ct值与起始模板数(NA3信)之间的相关性方程为：NAS0=10(-0.279Ct)；SPS基因标准曲线的相关系数为R=0.99571，相关性高，该基因Ct值与起始模板数(SPS0)之间的相关性方程为：SPS0=10(-0.286Ct+12.668)。
2．2 熔解曲线分析
采用SYBR Green I荧光嵌合法检测时，由于SYBR Green I可以嵌合进所有的双链DNA的小沟区域，受激发而发出荧光，因此必需做PCR反应的特异性检测，一般通过熔解曲线来分析其扩增特异性，理想的熔解曲线应该是单峰型曲线，如果出现两个或两个以上的峰，说明有引物二聚体等非特异性扩增产生，在本实验中，通过对NAsl和SPS这两个基因的熔解曲线分析(图5、图6)可以看出，这两个基因的熔解曲线都是单峰型，说明在PCR扩增过程中，没有出现非特异性扩增，由此推断定量PCR扩增所获得的数据是可靠的。
2．3 NASl和SPS基因起始模板数的计算
在本实验中，选取8株PCR检测为阳性的植株和1株非转基因对照植株，利用SDS法提取基因组DNA，每个样品做3个重复，进行定量PCR反应，获得扩增曲线，荧光域值的设定与制作基因标准曲线时相同，获得待测样品的CC值(表2)，并由方程：NAS0=10(-0.279Ct+12.3315)计算出该样品NAS1基因的起始模板数，由方程：SPS0=10(-0.286Ct+12.668)计算出该样品SPS基因的起始模板数，由于水稻内参基因SPS是纯合二倍体，而转基因当代的外源目的基因是纯合体的几率极小，因此NAS1起始模板数除以SPS起始模板数所获得的数据，乘以2就是目的基因在水稻基因组中的拷贝数(表3)，通过目的基因NASl和水稻内源参照基因SPS起始模板数的比较，结果显示：阴性对照为0.038+0.000，