抗生素微生物检定法
一、目 的：阐述抗生素微生物的检定法。 二、适用范围：适用于抗生素微生物检定法。 三、责 任 者：品控部。 四、正 文：
1 简述
抗生素微生物检定法，依试验设计原理不同，可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法。后二者被列为抗生素微生物检定的国际通用方法。中国兽药典采用管碟琼脂扩散法。
抗生素管碟检定法是利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈线性关系，通过比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。
抗生素效价以“单位（u）”或“微克（ug）”表示。 2 仪器与用具
2.1 操作室 光线明亮，操作室应分为两部分，彼此分开；一部分为一般操作间，一部分为半无菌操作间。半无菌操作间，设有紫外线灯达到空气消毒。应装有空调设备，控制室温在20-25℃。操作台可用稳固的水泥台，台面用玻璃板垫平，用水平仪校准，保持水平。室内注意抗生素的污染。
2.2 双碟 为硬质玻璃或塑料培养平皿，内径约90mm,高16-17mm,碟底厚薄均匀水平,无气泡.碟底平度检查,可将双碟放在水平台上,下垫一张白纸,碟内加2-3ml,再滴加蓝墨水,观察蓝色深汪是否一致.用过的双碟经高压灭菌倒出培养基后,置玻璃仪器专用洗液或其他清洗液中浸泡过夜,冲洗,沥干,置150-160℃干热灭菌2小时或高压121℃蒸气灭菌30分钟，备用。
2.3 陶瓦盖 内径约为103mm，外径108 mm，平坦，吸水性强，应定期干燥、清洗。 2.4 钢管 内径（6.0±0.1）mm,高(10.0±0.1) mm，外径（8.0±0.1）或（7.8±0.1）mm，每套钢管重量差异不超过±0.05g，内外壁及两端面光洁平坦，管壁厚薄一致。每次使用后应置1：1000新洁尔灭溶液内，浸泡2小时以上，进行灭菌后再行洗涤，先用水洗涤，超声波超声30分钟或用沾有去污粉的纱布条擦内外壁，用水冲洗，淋干，再用蒸馏水冲洗3次后，置带盖的溶器内，在150-160℃干热灭菌2小时备用。
2.5 钢管放置器 置于半无菌操作间内，有6孔和4孔两种，钢管下落时应垂直平稳、位置正确，双碟升降平稳。应保持清洁，防止抗生素污染。可定期用75%乙醇棉擦试，并用乙醇棉炎焰烧小孔。置钢管的玻璃管定期干烤灭菌。
2.6 恒温培养箱 隔水式为宜，35-37℃及24-26℃，隔板上可备有带孔的玻璃板并垫平。
2.7 灭菌刻度吸管 吸取菌液及培养基用。试验用后应立即置5%石炭酸或者0.2%新洁尔灭溶液中消毒后再按玻璃容器常规洗涤。吸口处塞入脱棉（应松动，透气），置适宜容器中，120℃以上干热灭菌2小时或121℃蒸气灭菌30分钟，烘干备用。
2.8 玻璃容器包括滴定管、移液管、刻度吸管、容量瓶等，按“玻璃器皿检定规程”进行标定，要符合一等品规定，每次应用前用清洁液浸泡，水冲洗、蒸馏水冲洗3次，淋干。
2.9 称量瓶 具塞，重量在10 g以下。用毕先用水冲洗、淋干，置清洁液浸泡2小时以上，水先、蒸馏水冲洗3次，置洁净的大平皿中，在120℃干热3小时，待冷至70-60℃时，取出置于干燥器中备用。
2.10 毛细滴管 用玻璃管拉制，管口光滑。应用前清洁液浸泡、水冲洗、蒸馏水冲洗3次，置适宜容器中，在120℃干燥3小时备用。
2.11 天平 分析天平，感量0.1mg。 2.12 抑菌圈直径（面积）测量仪。
2.12.1 可用CHB型抑菌圈面积测量仪及适当的测试仪。仪器必须按抑菌圈测量仪检验规程检验，符合规定者方能应用。
2.12.2 游标卡尺 精度0.05 mm，长度125 mm。
2.13 超净工作台 用于菌种的接各或传代。超净工作台须置洁净工作室或半无菌室内。
3 试液
3.1 灭菌缓冲液 制备缓冲液的试剂应为分析纯，配制后的缓冲液应澄明，分装于玻璃容器内，经121℃蒸气灭菌30分钟备用。
3.1.1 磷酸盐缓冲液（PH6.0）取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加水使成1000ml，滤过。
3.1.2 磷酸盐缓冲液（PH7.0）取磷酸氢二钾9.39g与磷酸二氢钾3.5g，加水使成1000ml，滤过。
3.1.3 磷酸盐缓冲液（PH7.8）取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使成1000ml，滤过。
3.1.4 磷酸盐缓冲液（PH0.5）取磷酸氢二钾35g，加氢氧化钾液（10mol/L）2ml，加水使成1000ml，滤过。
4 培养基
培养基中原料的质量对抑菌圈边缘清晰度及试验结果的精确度影响较大，因此应对原材料进行预试验，挑选适当的品牌使用。制成的培养基不应有沉淀，如产生沉淀，可在配制培养基后，置115℃，20分钟溶化，趁热用纸浆减压或适宜方法过滤，调整PH值，分装灭菌备用。
根据中国兽药典2005年版，抗生素微生物检定法中选用不同处方的培养基。目前市场已有干燥培养基商品生产、供应。临用时按照使用说明书进行配制，但注意培养基的PH，应符合规定，否则必须校正后，灭菌备用。
5 试验用菌种
检定用标准菌种，由中国药品生物制品检定所提供，为冷冻干燥菌种。 5.1 菌种的复苏与保存 在无菌室或超净工作台内进行。 5.1.1 菌种的复苏
5.1.1.1 把冻干菌种管、灭菌1 ml毛细滴管、双碟、镊子、营养琼脂斜面数支，移入接种室或超净工作台。
5.1.1.2 将冻干菌种管外壁用磺酒擦洗消毒、稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端，使骤冷而炸裂。
5.1.1.3 取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取1支灭菌毛细滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌块搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将毛细滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面置35-37℃培养22-24小时。
5.1.1.4 取出培养物，仔细观察菌苔形态、有无杂菌、涂片、革兰氏染色镜检，呈典型菌落后，转种植代即可应用。如发现菌形不典型，可进行平板分离单菌落。
5.1.2 菌种的接种与保存
5.1.2.1 准备需用的培养基，培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用，标签一注明菌名用接种日期。自冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。
5.1.2.2 点燃酒精或其他灯，在左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒种，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。右手用无名指、小指及掌部夹住棉塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拨开棉塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒，并将菌种管口移至火焰旁。堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面1支，照上述操作打开棉塞，将接种环但入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。
5.1.2.3 取出接种棒，在火焰旁将培养基管用棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。
5.1.2.4 将已接种毕的细菌管置35-37℃培养22-24小时，霉菌管一般置24-25℃霉菌
培养箱内培养7日。取出后放入冰箱保存，一般1-3个月转种一次。
5.2 菌悬液的制备
5.2.1 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis CMCC(B)63501）悬液取枯草芽杆菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物加灭菌水1-2ml将菌苔洗下，制成悬液，用吸管将此悬液接种至盛有营养琼脂培养基的扁培养瓶内，均匀摊布，在35-37℃培养7日。取菌苔少许涂片，革兰氏染色镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水10ml将芽孢洗下，制成芽孢悬液，合并至灭菌大试管内，在70-75℃水浴内加热30分钟将菌体杀死，待冷后放冰箱贮藏为浓菌液。
日常用菌悬液取上述浓菌液，用灭菌水1：3稀释至灭菌试管中，冰箱保存备用。 5.2.2 短小芽孢杆菌[Bacillus pumilus aureus CMCC(B)26003]悬液取短小芽孢杆菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备芽孢悬液。
5.2.3 金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus CMCC(B)26003]悬液取金黄色葡萄球菌工作用菌种的营养琼脂斜面培养物，用接种环取菌苔少许接种至营养琼脂斜上，在35-37℃培养20-22小时，临用时，用灭菌水将菌苔洗下，制成悬液。此液在冰箱保存，可使用日。
5.2.4 藤黄微球菌[Micrococcus luteus CMCC(B)28001]悬液取藤黄微球菌工作菌种的营养琼脂斜面培养物，用1ml培养基Ⅲ将菌苔洗下，用吸管移至盛有营养琼脂培养基的扁培养瓶中，将菌液布满培养基表面，将培养瓶反放于培养箱中26-27℃培养24小时后，取出用吸管吸取培养基Ⅱ5ml，至培养瓶中，将菌苔洗下，合并菌液至灭菌大管中备用。该菌液在冰箱中保存，可使用1-2月。
5.2.5 大肠杆菌[Escherichia coli CMCC(B)441033]悬液取大肠杆菌工作用菌种的营养琼脂斜面培养物，照金黄色葡萄球菌悬液制备方法进行，此菌液只供当天使用。
试验菌的菌龄对抑菌圈边缘清晰度有一定影响，保持菌种的新鲜，对易变的菌株如藤黄微球菌等在制备菌液前进行单菌落的分离，选择典型菌落以保持悬液中菌群的一致性，所得抑菌圈边缘清晰、整齐。
6 操作方法 6.1 称量
6.1.1 称量前，将标准品从冰箱取出，使与室温平衡；供试品应放于干燥器内至少30分钟方可称取。
6.1.2 称量供试品与标准品应用同一天平；吸湿性较强的抗生素，在称量前1-2小时更换天平内干燥剂。
6.1.3 标准品与供试品的称量最好一次取样称取，不得将已取出的标准品或供试品倒回听容器内，标准品称量不可少于20mg，取样后立即将称量瓶或适宜的容器及被称物盖好，