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第四章 霍乱弧菌的生物危害评估报告
霍乱(cholera)是由霍乱弧菌所致的烈性肠道传染病，临床表现轻重不一，典型病例病情严重，有剧烈吐泻、脱水、微循环衰竭、代谢性酸中毒和急性肾功能衰竭等。治疗不及时常易死亡，属甲类传染病。过去将古典生物型(classical biotype)霍乱弧菌所致的感染称为霍乱，由爱尔托生物型(EI Tor biotype)所致者称副霍乱。鉴于霍乱弧菌的两个生物型在形态和血清学方面几乎一样，两种弧菌感染的临床表现和防治措施基本相同，因此，分别命名为霍乱和副霍乱并无必要，而统称为霍乱。世界第五、六次大流行与古典生物型有关，第七次则由印尼地方流行的爱尔托生物型所致，延续至今未止。而1992年于印度及孟加拉等地流行的霍乱，已证实是新血清型所致，该菌定名为0139。现已波及巴基斯坦、斯里兰卡、泰国、尼泊尔、我国香港及欧美等地，似有形成第八次流行之势。
【流行病学】
病人与带菌者是霍乱的传染源。典型病人的吐泻物含菌量甚多，每ml粪便可含107～109弧菌，这对疾病传播起重要作用。轻型病人易被忽略，健康带菌者不易检出，两者皆为危险传染源。潜伏期带菌者尚无吐泻，恢复期带菌者排菌时间一般不长，两者作为传染源的意义居次要地位。本病主要借水传播，污染的食品和手以及苍蝇等，对传播疾病也起一定作用。
男女老幼均对本病易感。在新感染区，成人比儿童易受感染；在地方流行区，儿童发病率较成人为高，后者对感染的抵抗力随着对霍乱弧菌抗体滴度的升高而增加。病后丙次发生严重感染者少见。实验感染霍乱弧菌的志愿者，对第二次感染的具高度抵抗力，其时间至少可维持3年。古典霍乱弧菌初次感染的免疫力能(100%保护力)较埃尔托弧菌者(90%保护力)为强。霍乱患者虽然对新感染的保护免疫可达数年，但对霍乱毒素和细菌的肠抗体仅维持一致数月。
【危害程度分级】
微生物按其是否致病、致病力强弱、危害人体的严重性、传染性的大小、临
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近人群的抵抗力、有无免疫制剂和特效治疗药物等综合评价，可分为四个不同的危害等级。霍乱弧菌属于3级危险。
3级危险（对个体具有极大危害，对群体具有较大的危害性）：指有特殊危险的致病菌。感染后症状较重，并可能危及生命，或者缺乏有效的预防方法、发病后不易治疗的微生物。
【实验室感染的原因及预防】
（一）技术操作可能导致的感染及其预防措施。
1. 接种：应使用无弹力的铂丝接种环，结核菌接种后接种环火焰灭菌易崩散，酒精灯烧灼时要特别注意。
2. 混匀：吸管吸吹菌液时不要产生气泡，应沿容器壁排出。 3. 研磨：最好使用组织研磨器，乳钵易产生气溶胶。
4. 移液：吸管上端的棉花松紧要适度，吸液时要从管底吸取，吹出时要轻缓，不要全部吹净，以免产生气泡，形成气溶胶。
5. 开封：要避免压力和气流的急剧变化。
6. 离心：离心管套底垫要完好，使用匹配的管、套、离心头，加盖。 7. 注射：做好个人防护，正确使用注射器。
8. 搬运：室内移动要避免滑落，移出室外要有坚实密闭的外包装。 （二）技术保障
1. 双人原则，不允许单人操作1、2类病原。
2. 入口处应有危险警示标识，并标明所操作的微生物的种类。
3. 培训考核上岗，掌握相关技术操作要领，熟悉规章制度，适应工作环境。 4. 完备的管理措施，技术操作规范。
5. 良好的工作行为可降低生物危害风险。 【安全防护】
(一) 严格遵守实验室安全操作规程，实验室的技术人员必须经过生物安全培训后方可上岗。
(二) 实验室应严格限制非实验人员进入，减少实验室内外交叉生物污染。完成实验工作离开实验室，要关好门窗。
(三) 进入实验室应避免携带非必需物品。
(四) 进入实验室，工作人员应穿着工作服，操作时应穿戴防护隔离衣、口罩、帽子和手套，长发者应将头发装束在帽子内。
(五) 实验过程中绝对禁止吸烟、饮食等，不要以手抚头面部等。
(六) 试验前须开启紫外线灯对实验室和操作区域进行照射消毒1小时以上；试验结束后，立即开启紫外灯进行照射消毒2小时以上。
(七) 任何试验的开始和结束后，操作人员要用70%酒精浸泡双手或仔细擦后，用清洁剂或清水洗净。
(八) 每次试验结束后，必须清理好实验台，并用70%酒精液或3-5%石炭酸擦洗实验台面。
(九) 实验室中的生物危险品要根据检查项目和性质不同，局限在相应的试验区间，不得随意将其带到其它的实验室。
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(十) 实验室内任何微生物的样本，废弃物都必须经高温高压灭菌后，方可按一般垃圾处理。 【安全保障】
(一) 首先各级实验室应按等级要求完善实验设施，如简易安全柜内的抽气排风功能、紫外灯消毒功能，生物安全柜维护与除菌滤膜定期更换等。 (二) 实验室采集病人标本时要格外注意。
(三) 普通实验室应注意气流方向，实验过程中尽量避免强气流变化而产生气溶胶（如﹕涂片、染色过程中）。
(四) 细菌的分离培养、菌种开封、转种、研磨、稀释等操作，各级实验室均应在简易安全柜或生物安全柜中进行。
(五) 使用接种环进行操作时，接种环应在工作灯的内焰中燃烧，以避免菌液或菌块飞溅。
(六) 稀释菌液时，吸管、针管要缓慢插入试管或烧瓶底部，小心操作避免产生气泡或气溶胶。
(七) 使用注射器加样时，用过的针头切勿再重新入套或拔开注射器与针头，应直接放入锐器收集器，以免划破皮肤造成接种感染。
(八) 菌株库要设专人管理，并按照国家微生物菌毒种管理办法执行。
(九) 进行毒菌操作过程中，不要穿戴巳经污染的防护性手套触摸门柄、仪器或毒菌区以外区域，避免由于粗心扩大污染范围。
(十) 试验结束后，操作过程中所有可能与生物危险物接触或被污染的试验器械和物品，能够高压消毒的必须高压消毒，不能进行高压消毒的设备、仪器，应使用有效的消毒剂擦洗后再以紫外灯近距离长时间消毒。
(十一)实验中发生意外污染情况，应立即通知主管人员并做好处理污染物和相应区域的准备，不得擅自采用其它禁止的方法进行消毒处理。
(十二)实验室主任应制定规章和程序，只有告知潜在风险并符合进入实验室特殊要求(如，经过免疫接种)的人，才能进入实验室。
(十三)操作致病性微生物时，实验室入口处应贴有生物危险标志，并显示以下信息：有关病原、生物安全级别、免疫接种要求、研究人员姓名、电话号码、在实验室中必须佩带的个人防护设施、出实验室所要求的程序。
(十四)实验室主任为实验室人员特别制定的标准操作程序或生物安全手册中，应包括生物安全程序。对于有特殊风险的人员，要求阅读并在工作及程序上遵照执行。
(十五)实验室主任保证实验及其辅助人员接受适当的培训，包括和工作有关的可能存在的风险、防止暴露的必要措施和暴露评估程序。 （十六）实验室所用任何个人防护装备应符合国家有关标准的要求。实验室应确保具备足够的有适当防护水平的清洁防护服供使用。还应穿戴其它的个人防护装备，如手套、防护镜、面具、头部面部保护罩等。
(十七)处理样本的过程中易产生高危害气溶胶时，要求同时使用适当的个人防护装备、生物安全柜和/或其它物理防护设备。如可产生含生物因子的气溶胶，应在适当的生物安全柜中操作。
(十八) 实验用鞋应舒适，鞋底防滑。应用皮制或合成材料的不渗液体的鞋类。在从事可能出现漏出的工作时可穿一次性防水鞋套。在实验室的特殊区域（例如有防静电要求的区域）或BSL-3和BSL-4实验室要求使用专用鞋（例如一次性或橡胶靴子）。
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【实验室废物处理 】
一、实验室废弃物处理的目的：
(一) 将操作、收集、运输、处理及处置废弃物的危险减至最小； (二) 将实验室废弃物对环境的有害作用减至最小。 二、实验室污物处理及消毒
(一) 实验室含有生物危险物的临床标本及被污染的一次性用品，试验完成后，应在操作台或实验区域内以紫外灯近距离照射消毒 2小时以上，再经高压消毒后方可丢弃或焚烧。
(二) 可重复使用的实验用品及器材，完成实验后，应在操作台或实验区域内经紫外灯近距离照射消毒2小时以上后，再交有关人员进行高压消毒和煮沸洗刷。
(三) 实验用的试管、吸管、注射器，须装在加盖不漏的容器内，经高压灭菌后取出。
(四) 培养物或实验室垃圾，在丢弃前必须经高压消毒和紫外灯近距离长时间照射处理。不允许积存垃圾和实验室废弃物。已装满的容器应定期运走。在去污染或最终处置之前，应存放在指定的安全地方，通常在实验室区内。
(五) 实验室废弃物应置于适当的密封且防漏容器中安全运出实验室。有害气体、气溶胶、污水、废液应经适当的无害化处理后排放，应符合国家相关的要求。
(六)实验过程中，如标本或含标本的前消化处理液被打翻污染了操作台或地面，应以吸满70%酒精的卫生纸覆盖污染区，15分钟以后卫生纸方可移去。 (七) 实验室内未经消毒的污水，禁止直接排入公共排水系统，更不允许混入居民生活垃圾。 【意外事故的处理】
(一) 如果发生意外，必须立即通知实验室主管人员，并在有关人员的指导监督下对出事现场进行处理，绝对禁止未经报告而私自对出事现场给予非规范的处理。
(二) 实验过程中，如污染物溅落到身体表面，或有割伤、刺伤、烧伤、烫伤等情况发生，应立即停止实验工作进行紧急处理，更换被污染的实验服，皮肤表面用消毒液清洗，伤口以碘酒或酒精消毒，眼睛用无菌生理盐水冲洗。
(三) 如果发生菌液溢出，含菌种的培养管破碎等，造成中 、小面积污染，可用比污染面积大25%以上的纱布覆盖污染区域，边缘用脱脂棉围住，向纱布倾倒5%苯酚溶液或70%的酒精，浸泡2小时以上（其间适量加溶液防止干燥），再经紫外灯近距离（1米内）照射2小时以上；被污染的器械、容器等立即浸泡于70%酒精中2小时以上，实验完成后再进行高压消毒处理。
(四) 如果发生气溶胶污染或大面积污染，应立即停止实验并关闭实验室，对污染区域进行紫外灯照射消毒过夜；第二天对污染区进行24小时封闭空气熏蒸消毒（乙醛消毒法﹕5ml乙醛＋2g高锰酸钾/m3空间）。
(五) 绝对禁止使用的事故处理方法﹕
1. 任何有可能造成污染面积扩大的去污方法，如使用70%乙醇或甲酚皂液擦洗被污染的区域。
2. 直接用火焰对未经任何处理的污染地面、操作台、器械等进行烧灼处理。 3. 使用消毒效果未经证实的消毒剂进行消毒。
4. 使用低浓度的消毒剂和紫外灯进行短时间、长距离的照射。
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第五章 流感病毒的危害评估报告
流感病毒属正粘病毒科，分甲、乙、丙三型。具有“变异”特性，不断产生新的亚型。可引起人或家禽的流行性感冒。这是一种急性呼吸道传染病，它具有突然暴发、迅速蔓延、波及面广的特点。在人群中，它的发病率高，病死率低，多发于青少年，恢复快，具有一定季节性。而禽流感发病率和病死率高，季节性不强，来源常不明。20世纪曾有4次流感大流行。流感流行时造成的经济损失名列各传染病之首。流感是第一个实行全球监测的传染病。
病人和病禽是主要的传染源。传播途径以空气飞沫传播为主，也存在通过水源、密切接触、垂直传播、蚊虫传播等多种途径。人群普遍易感，病后免疫时间短，而流感病毒变异性大，但型间无交叉免疫，所以人在一生中可多次患流感。
流感病毒在外界的抵抗力弱，在56℃30分钟条件下易被灭活，在室温下传染性很快丧失，100℃1分钟即被灭活，但在0～4℃能存活数周，在 -20℃真空干燥条件下可长期保存。对紫外线和化学有毒剂敏感。病毒暴露于通常使用的各种消毒剂和固定剂后，病毒即失去感染性。
流感极易传播，因此发现有流感病人，应及早隔离和治疗。流感流行期间尽可能避免人群集聚，注意房屋通风，提倡在公共场所戴口罩，病人的口鼻腔分泌物及污染物应随时消毒。疫苗接种对预防流感有一定效果。保持环境卫生，养成良好的卫生习惯也能起预防作用。流感是一自限性疾病，可使用抗流感病毒药物和对症治疗来减轻症状。用抗菌素防止细菌继发感染产生的并发症。 1．实验模式
1．1 流感病毒的分离培养
流感病毒大量存在于病人痰液、咽拭子和病禽尸解脏器中。分离流感病毒时，可用鸡胚，最好用SPF鸡胚，但一般只采用尿囊腔接种；也可用狗肾细胞（MDCK）。 1．2流感病毒血清学诊断
血凝抑制试验（HI法）或微量中和法。
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