一部修订附录 Ⅸ T 甲醇量检查法
Ⅸ U 二氧化硫残留量测定法 Ⅸ Q 农药残留量测定法
XVIII J-中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则-新增
二部修订附录
附录I A 片剂（增订口崩片） 附录Ⅱ 药用辅料 附录Ⅵ G 黏度测定法 附录Ⅸ B 澄清度检查法
附录Ⅹ A 崩解时限检查法（增订口崩片检查法） 附录Ⅹ K 锥入度测定法
附录ⅩⅨ F 药品杂质分析指导原则
二部新增附录
附录ⅩⅨ R 药用辅料性能指标研究指导原则
附录ⅩⅧ J 中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则1
本法用于中药材(包括药材及部分药材饮片)及基原物种的鉴定。
DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别方法的有效补充。由于不同物种的DNA序列是由腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)四种碱基以不同顺序排列组成，因此对一定长度的DNA序列进行分析即能够区分不同物种。
中药材DNA条形码分子鉴定是以核糖体DNA第二内部转录间隔区(ITS2)1为主体条形
注
码序列鉴定中药材的方法体系，其中植物类中药材选用ITS2为主体序列，以叶绿体psbA-trnH
注2
为辅助序列，动物类中药材采用细胞色素c氧化酶亚基I(COI)3为主体序列，ITS2为辅助序
注
列。
一、仪器的一般要求
所用仪器有电子天平、离心机、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)仪、电泳仪和测序仪。
DNA序列测定用测序仪，是一台具有自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段中碱基顺序或大小，以及定量用精密仪器。测序方法主要采用双脱氧链终止法，又称Sanger法，传统Sanger法采用同位素标记，目前常用的自动测序仪是基于毛细管电泳和荧光标记技术的DNA测序仪，从而大大提高了DNA测序的速度和准确性。4种双脱氧核苷酸(ddNTP)的碱基分别用不同的荧光进行标记，在通过毛细管时，不同长度的DNA片段上的4种荧光基团被激光激发，发出不同颜色的荧光，被电荷藕合元件图像传感器(charge-coupled device，CCD)检测系统识别，并直接翻译成DNA序列，获得供试品的峰图文件和序列文件。
测序仪的配置包括毛细管电泳仪、计算机、液晶显示器及数据采集和分析软件。仪器主要具有进样、电泳、检测、清洗四大功能，其中进样部分的主要作用是放置待检测的样品；起电泳功能的主要部件是毛细管和泵，在60℃条件下电泳，区分不同长度的DNA片段；检测部件主要是激光电源、激光管、光电转换装置；清洗部分主要作用是对毛细管进样口的清洗，保证自动灌胶、上样、电泳过程中无交叉污染。
二、 测定步骤
1
新增指导原则。若正文品种采用该法，则按方法予以收载。
本法主要包括供试品处理、DNA提取、DNA条形码序列PCR扩增、电泳检测和序列测定、序列拼接及结果判定，主要步骤如下。
1. 供试品处理
按药材和饮片取样法(《中华人民共和国药典》附录IIA)取样，除另有规定外，药材和饮片使用75%乙醇擦洗表面后晾干，称取10-100 mg备用。具体见各药材项下。
2. DNA提取
DNA的提取包括使用研钵或研磨仪破碎细胞，释放DNA，用试剂盒法进行DNA的分离和纯化等步骤，目前常用试剂盒包括植物基因组DNA提取试剂盒和动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒，实验选用的试剂盒须能够提取到满足后续实验要求的模板DNA。
由于植物类中药材种类繁多，可根据所鉴定的中药材的具体情况对提取方法加以改进。例如：植物细胞内含有大量多糖、多酚等次生代谢产物，这些物质在提取DNA的过程中与DNA共沉淀，形成粘稠的胶状物，难以溶解或氧化产生褐变，严重影响DNA提取的产量与质量，以及后续的PCR扩增实验。但如在提取DNA过程中加入抗氧化剂β-巯基乙醇，则可抑制氧化反应，避免其褐化。再如：PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA提取过程中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。因此若将PVP和β-巯基乙醇配合使用，能够有效地防止DNA提取过程中多酚及多糖的污染。此外，乙二胺四乙酸(EDTA)能螯合Mg2+或Mn2+，从而抑制DNA酶(DNase)活性，防止DNA被其降解；在天然状态下，DNA与蛋白质以DNA蛋白质复合物(DNP)的形式存在，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与DNA形成复合物，使细胞中的DNP释放出来，该复合物在高盐溶液(>0.7mol/L NaCl)中能充分溶解，存在于液相中，通过有机溶剂抽提，去除蛋白质、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使DNA分离出来。三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)(pH8.0)溶液可提供一个缓冲环境，防止DNA被降解。
根、根茎、茎木类、皮类 通常根和根茎组织中多酚、多糖含量高，在研磨时多酚极易氧化成醌类，使DNA带有一定颜色，在纯化过程中很难去除，影响后续的PCR反应，所以在提取根及根茎类药材DNA时一定要注意多糖、多酚的去除。提取此类药材DNA时水浴时间一般为90分钟，对于质地坚硬的根、根茎类和茎木类药材，可以延长水浴时间并降低水浴温度，如56℃水浴8-12小时，使得DNA充分释放到缓冲溶液中。此外，根茎类药材由于富含纤维和淀粉等贮藏物质，需加大样品量才能提取到足量DNA，可用大体积离心管(5 mL或15 mL)抽提。皮类中药材组织中富含薄壁组织和纤维等，加液氮不易研磨成细粉，需适当增