生物化学实验报告
动物营养研究所
张树润 2015.10.12
猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活性测定
一．实验目地
1.通过实验了解活性物质的分离提取。 2.了解超氧化物歧化酶的基本功能与应用。
二．实验原理
超氧化物歧化酶是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅基，因此它对热、PH、以及某些理化性质表现出异常的稳定性。该酶首次从牛红细胞中分离得到，是一种蓝色含铜蛋白，之后，研究发现该蛋白酶具有催化氧发生歧化反应的能力，因此将其命名为超氧化物歧化酶
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。超氧化物歧化酶是一种能专一地清
除超氧离子自由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、抗炎抗癌等作用，因而在医药（如关节炎、红斑狼疮等疾病的治疗3）、化妆品(有防晒抗炎效果4)、食品工业（SOD灵芝菌5等）等方面具有了广泛的应用前景。
超氧化物歧化酶是广泛存在于生物体内的一种金属酶, 可催化超氧阴离子自由基(O2-)与H+发生歧化反应, 生成H2O2和O2。SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。
超氧化物歧化酶按照它所含金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。
SOD提取、纯化制备方法各异, 常用方法有经典的溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等6-7。本实验采用有机溶剂沉淀法8以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下方法：邻苯三酚自氧化法9、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。
该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为一个酶单位。
样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一定范围内，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围1-1000μg。
三． 实验试剂与器材
1. 实验试剂
ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐溶液、3mmol/L邻苯三酚溶液等
2. 实验器材
紫外光分光光度计、可见光分光光度计、分析天平、具塞试管、刻度吸管、离心机、烧杯、移液枪、试管架、EP管等。
四． 实验方法
1.SOD的提取
[1]取新鲜猪血20ml于50ml离心管，4000r/min，10min离心，去上层血浆，取下层红血球粘稠液量其体积，然后加入2倍体积的0.9%NaCl溶液清洗，4000r/min，10min离心，弃上层清液，再加入2倍体积的0.9%NaCl溶液重复清洗一次，4000r/min，10min离心，得洗净的红血球粘稠液。
[2]向洗净的红血球中加入等体积的蒸馏水，剧烈搅拌30min，使其充分溶血。再向溶血液中缓慢加入预冷的0.35倍体积的95%乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，匀浆呈暗红色，再继续搅拌15min，4000r/min，10min离心，去变性蛋白沉淀物，得上层液，量其体积即为除血蛋白上清体积，留样500ul（样1）。将上层液用2层纱布进行过滤除去脂肪物质，然后将清液在65-70℃恒温水浴中进行热处理，15min后取出迅速冷却到室温，4000r/min，5min离心除去沉淀，得浅黄色粗酶液，量其体积即为热变性后上清体积，留样200ul（样2）。
[3]向粗酶液中加入等体积的丙酮溶液，冰箱静置4小时，4000r/min，10min，弃上清液，得沉淀。将沉淀物用等体积预冷的丙酮溶液清洗两次，离心收集沉淀，自然干燥即得淡绿色成品，按1mg/ml溶于蒸馏水，为丙酮沉淀后体积，备用（样3）。