分子生物学题库 n一 概论 1、生物大分子：具有较大的分子量，由简单的小分子（核苷酸或氨基酸）排列组成，蕴含丰富信息并且具有复杂的空间结构。 2、分子生物学发展简史 （1）准备阶段( 19世纪后期-20世纪50年代初 )期间的重大突破：①确定了蛋白质是生命的主要基础物质；②确定了生物遗传的物质基础是DNA。 （2）现代分子生物学的建立和发展阶段（20世纪50年代初-70年代初）1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型作为现在分子生物学诞生的标志。期间的主要进展：①“中心法则”的建立；②对蛋白质结构和功能的进一步认识。 （3）初步认识生命本质并开始改造生命的深入发展阶段（20世纪70年代以后）以基因工程技术的出现作为新的里程碑，标志着人类开始了深入认识生命本质并能动改造生命的新时期。期间的主要发展：①重组DNA技术的建立和发展；②基因组的研究；③单克隆抗体及基因工程抗体的建立和发展；④基因表达调控机制；⑤细胞信号转导机制的研究。 二 基因的结构与功能 1、基因：DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。 2、基因组：泛指一个有生命体、病毒或细胞器的全部遗传物质。 3、卫星DNA：由2-10bp组成重复单位，重复单位成串排列而成，由于这类序列的碱基组成不同于其他部份，可用等密度梯度离心法将其与主体DNA 分开。 4、超基因：人体基因组中几个属于中度重复序列的长分散片段的基因簇，在一个基因簇内含有几百个功能相关而结构不同的基因。 5、多基因家族：由某一祖先基因经过重复和变异所产生的一组基因。多基因家族大致可分为两类：①基因家族成簇地分布在某一条染色体上，其可同时发挥作用，合成某些蛋白质；②一个基因家族的不同成员成簇地分布不同染色体上，这些不同成员编码一组功能上紧密相关的蛋白质。 6、假基因：在多基因家族中不产生有功能的基因产物的成员。 7、病毒基因组的结构特点 1、病毒基因组很小，且大小相差较大。 2. 病毒基因组可以由DNA组成，或由RNA组成。 3.多数RNA病毒的基因组是由连续的RNA链组成。 4.基因重叠。 5.基因组的大部分可编码蛋白质，只有非常小的一部份不编码蛋白质。 6.形成多顺反子结构。 7.病毒基因组都是单倍体（逆转录病毒除外）。 8.噬菌体（细菌病毒）的基因是连续的，而真核细胞病毒的基因是不连续的。
8、细菌基因组的结构特点 1.形成类核 2.染色体DNA通常与细胞膜相连 3.具有操纵子结构：结构基因为多顺反子，若干个功能相关的结构基因串联在一起，受同一个调节区的调节 数个操纵子还可以由一个共同的调节基因（ regulatory gene ）即调节子（regulon）所调控 4． 结构基因都是单拷贝，rRNA基因为多拷贝，基因组DNA中不编码的部份所占比例比真核细胞基因组少得多,比病毒基因组多 5.不出现基因重叠现象 6具有同基因（isogene）：编码同工酶 （isoenzyme） 7.DNA分子中具有各种功能的识别区域如：复制起始区（OriC）复制终止区（TerC）、转录启动区转录终止区 8.具有终止子（termintor）这些区域往往具有特殊的顺序，并且含有反向重复顺序 9.结构基因中无内含子 9、真核生物的基因组特点 （1）每一种真核生物都有一定的染色体数目； （2）基因组远远大于原核生物基因组，具有许多复制起始点； （3）真核基因都由一个结构基因与相关的调控区组成，转录产物为单顺反子； （4）真核生物含有大量重复顺序； （5）真核生物基因组内非编码序列占90％以上； （6）真核基因是断裂基因； （7）功能相关的基因构成各种基因家族； （8）真核生物基因组中存在一些可移动的遗传因素。 三 人类基因组计划 1、遗传作图（genetic mapping）：通过亲本的杂交或检查家族史来分析后代的基因或其他特异分子标记物间重组率，并用重组率来表示两个基因之间距离的线性连锁图谱。 2、物理作图（physical mapping）：应用分子生物学技术来直接分析DNA分子，测定人类基因组DNA分子的物理长度，从而构建能显示包括基因在内的、序列特征的位置图谱。 3、序列作图（sequence mapping）：测出人类基因组的全部DNA序列。 4、基因作图（gene mapping）：确定每一个基因的结构、特性和功能。 四 基因的表达与调控 掌握原核基因表达调控的基本概念及主要类型 1、基因表达调控，即对基因表达过程的调节，分为两个层次，即转录水平的调控和转录后水平的调控； 2、原核基因调控机制的类型与特点 （1）正转录调控：调节基因的产物是激活蛋白。 ①正控诱导：效应物使激活蛋白处于活性状态。 1
分子生物学题库 ②正控阻遏：效应物使激活蛋白处于非活性状态 （2）负转录调控：调节基因的产物是阻遏蛋白。 ①负控诱导：阻遏蛋白与效应物结合，结构基因转录。 ②负控阻遏：阻遏蛋白与效应物结合，结构基因不转录。 （3）可诱导调节：是指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。如乳糖操纵子。 （4）可阻遏调节：这类基因平时都是开启的，处在生产蛋白质或酶的工作过程中，由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达。如色氨酸操纵子。 掌握乳糖操纵子的负控诱导系统的结构和调节机理（葡萄糖效应及其机制） 1、乳糖操纵子包括： （1）启动子（promotor, P）； （2）操纵基因（operator, O）； （3）结构基因（Z、Y、A）：分别编码β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷透过酶、β-半乳糖苷乙酰基转移酶 2、乳糖操纵子调控模型的主要内容： （1）ZYA基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码； （2）该mRNA分子的启动子（P）位于阻遏基因（I）与操纵基因（O）之间，不能单独起始半乳糖苷酶和透过酶基因的高效表达； （3）操纵基因是DNA上的一小段序列（仅为26bp），是阻遏物的结合位点； （4）当阻遏物与操纵基因相结合时，lac mRNA的转录起始受到抑制； （5）诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵基因相结合，从而激发lac mRNA的合成。 3、葡萄糖效应（降解物抑制作用）： （1）概念：大肠杆菌生长在既有葡萄糖又有其他糖类(乳糖等)的介质中，只能利用葡萄糖，当葡萄糖耗尽后才能利用其他糖类，即葡萄糖阻断多种操纵子(葡萄糖敏感操纵子)的表达。 （2）机理：葡萄糖代谢降解物降低细胞内cAMP的浓度，不能与环腺苷酸受体蛋白（CRP）或称代谢降解物激活蛋白（CAP）形成足够的cAMP-CAP活性复合物以促使RNA聚合酶与启动子的结合，葡萄糖敏感操纵子不能表达。 掌握色氨酸操纵子与负控阻遏系统的调控机理、及弱化子的作用机理 1、色氨酸的合成有阻遏系统和弱化系统两个调节系统，不受葡萄糖或cAMP-CAP活性复合物的调控。 2、trp操纵子的阻遏系统 （1）trpR基因产物称为辅阻遏蛋白（aporepressor），与色氨酸相结合形成有活性的阻遏物，与操纵基因结合并关闭trp mRNA转录。 （2）效应物是色氨酸，是由trp操纵子所编码的生物合成途
径的末端终产物。 （3）当培养基色氨酸含量高，它与辅阻遏蛋白结合，与操纵基因结合，阻遏 mRNA 的转录；当色氨酸不足时，辅阻遏蛋白失去色氨酸并从操纵基因上解离，trp操纵子去阻遏，mRNA开始转录。 3、trp弱化子的作用机理 （1）弱化子：当操纵子被阻遏，RNA合成被终止时，起终止转录信号作用的那一段核苷酸序列。 （2）作用机理：在色氨酸操纵子的前导序列中可能存在前导肽，由1、2、3、4四个区组成，3-4 配对区正好位于终止密码子的识别区域。trp弱化子对RNA聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体的位置，当核糖体覆盖前导肽的1、2区时，3、4区形成茎-环结构，RNA聚合酶终止转录；当核糖体覆盖1区时，2、3区配对，RNA聚合酶继续转录。 掌握在DNA水平的基因表达调控：染色质结构、基因扩增、重排与交换。DNA甲基化对基因活性的调控 1、染色质结构改变：基因活跃表达时启动区部分DNA序列解开成单链，从而不能继续缠绕在核小体上而“裸露”于组蛋白表面。 2、基因重排：一个基因可以通过从远离其启动子的地方移到距它很近的位点而被启动转录。 3、基因转换：酵母的“交配型转换”现象，通过基因转换改变性别。 4、基因扩增：某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象。 5、DNA甲基化：DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导基因的活化和表达。 掌握真核基因转录调控中的顺式作用元件和反式作用因子的结构 1、启动子：在转录起始位点及其上游大约100-200bp内的一组具有独立功能的DNA序列，决定RNA聚合酶Ⅱ转录起始点和转录频率的关键元件，包括： （1）核心启动子（core promoter）：保证RNA聚合酶正常起始转录所必需的DNA序列，确定转录起始位点并产生基础水平的转录。包括转录起始位点和上游的-25到-30bp处的TATA盒。 （2）上游启动子元件（UPE）：包括-70bp附近的CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等，能通过TFII D复合物调节转录起始的频率，提高转录效率。 2、终止位点：3’端存在poly(A)位点，该位点上游15-30bp处有保守序列AATAAA。 3、增强子：指能使与它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。通常具有下列特性： （1）增强效应十分明显 （2）增强效应与其位置和取向无关。 （3）大多为重复序列: (G)TGGA/TA/TA/T(G)。 （4）增强效应有严密的组织和细胞特异性。 （5）要有启动子才能发挥作用, 但没有基因专一性。 2
分子生物学题库 （6）受外部信号的调控。 3、沉默子：某些基因的负性调节元件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。沉默子的作用可不受序列方向的影响，也能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。 4、反式作用因子：可使邻近基因开放(正调控)或关闭(负调控)的DNA结合蛋白，核内蛋白，包括： 1）DNA结合结构域： （1）螺旋-转折-螺旋：至少有两个α螺旋，中间由短侧链氨基酸残基形成“转折”。一个α螺旋负责识别DNA的大沟，另一个与DNA主链骨架非特异性结合。这类HTH蛋白以二聚体形式与DNA结合 （2）锌指：一个α螺旋与一个反向平行β片层的基部以锌原子为中心，通过与一对半胱氨酸和一对组氨酸之间形成配位键相连接，锌指环上突出的赖氨酸、精氨酸参与DNA结合。 （3）碱性-亮氨酸拉链结构：蛋白质分子的肽链上每隔6个氨基酸就有一个亮氨酸残基，结果就导致这些亮氨酸残基都在α螺旋的同一个方向出现。两个相同结构的两排亮氨酸残基就能以疏水键结合形成拉链型二聚体。该二聚体的氨基端的肽段富含碱性氨基酸残基，借其正电荷与DNA双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结合。 （4）碱性-螺旋-环-螺旋结构：羧基端100-200aa形成两个α螺旋被非螺旋的环状结构所隔开；氨基端是碱性区。该类蛋白形成同源或异源二聚体后，通过它们的碱性区与DNA相结合。 （5）同源域蛋白：分子中含有约60个氨基酸的保守序列，这些序列参与形成了DNA的结合区。C端有螺旋-转角-螺旋（HTH）样结构。 2）转录活化结构域：具有转录调控功能的催化区域，常以复合物形式出现，依赖于DNA结合结构域以外的30-100个氨基酸残基完成蛋白质-蛋白质之间的相互作用。 五 基因工程 1、基因工程(Genetic Engineering) （1）狭义：基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。其三大要素为供体、受体和载体。 （2）广义：DNA重组技术的产业化设计与应用，包括：①上游技术：外源基因重组、克隆和表达的设计与构建（即狭义的基因工程）②下游技术：含有重组外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养以及外源基因表达产物的分离纯化过程。 2、分子克隆：DNA重组分子大都需在受体细胞中复制扩增，故基因工程可称为为分子克隆。 3、基因工程中的重要工具酶
工具酶 DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶 功能 连接DNA片段，使切口封合 合成DNA，填补3ˊ末端 合成cDNA 使多聚核苷酸5ˊ末端磷酸化 使3ˊ羟基加尾 切除末端磷酸基 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA 4、载体 （1）概念：能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具，其本质为DNA。制备的目的基因或外源性DNA片段必须与合适的载体连接形成重组体，才能进入受体细胞并进行复制和表达 （2）载体应具备的特征 ①能自我复制并具较高的拷贝数； ②分子量一般<10Kb； ③带有遗传筛选标记； ④有适当的限制酶切位点，便于外源基因的插入和筛选； ⑤多克隆位点（MCS）：载体上具有多个限制性内切酶的单一位点，以供外源DNA插入。 （3）分类 ①克隆载体：能将载体外源基因在受体细胞中复制扩增并产生足够量目的基因的载体。 ②表达载体：能将外源基因在受体细胞中有效转录和正确翻译的载体。 （4）常用的载体：质粒、噬菌体、粘粒和病毒。 5、DNA重组的基本步骤 （1）切：从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA和载体分子切开； （2）接：用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片断接到载体上，形成DNA重组分子； （3）转：借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中； （4）增：短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中； （5）检：筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效表达的基因工程菌或细胞。 6、重组体的筛选和鉴定 （1）遗传标记表型特征筛选 ①抗生素抗性标记筛选：因大多数质粒载体带有抗生素抗性标记的特征（如 Ampr、Tetr等），当带有完整抗性基因的载体转化无抗性细菌后，被转化的阳性菌获得抗生素抗性基因而存活并形成噬菌斑，未转化菌不能存活，但应排除未重组的空载体。 ②双抗生素筛选法：某些质粒载体如pBR322质粒中装有Ampr3