本科学生综合性实验报告
学号 XXX 姓 名 XXX 学院 生命科学学院 专业、班级 实验课程名称 《遗传学实验》 教师及职称
开课学期 2011 至 2012 学年 上 学期 填报时间 2012 年 09 月 14 日
云南师范大学教务处编印
实验序号 实验 二 实验名称 诱变物质的微核实验 实验时间 2012年09月14日 一、实验预习 实验室 XXX 1．实验目的 ： （1）、了解微核发生的机制； （2）、掌握微核实验的一般程序和实践意义； （3）、掌握对实验动物进行药物处理的一般程序； （4）、掌握进行实验设计的一般程序和规则，并锻炼实践能力。 2． 实验原理、实验流程 ： （1）、实验原理： 微核 （Micronucleus）：微核主要是由外界损害因素(生物、物理、化学)作用致使细胞染色体丢失或断裂，在有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片或染色体因纺锤体受损而在分裂过程中行动滞后，分裂末期不能进入主核，形成了主核之外的核块，而在细胞浆中形成1个或数个独立于主核、直径小于主核的1/3、染色与主核一致但比主核淡的核小体，因比主核小，故称为微核。微核率的大小与作用因子的剂量或辐射累积效应呈正相关。 凡能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结损伤的化学物，都可用微核试验来检测。各种类型的骨髓细胞都可形成微核，但有核细胞的胞质少，微核与正常核难以鉴别。嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞由幼年发展为成熟红细胞的一个阶段，此时红细胞的主核已被排出，因胞质内含有核糖体，Giemsa染色后呈灰蓝色，成熟红细胞的核糖体已消失，被染成淡桔红色。骨髓中嗜多染红细胞数量充足，微核容易辨认，而且微核自发率低，因此，骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选细胞群。 本法用Giemsa染色法观察嗜多染红细胞的微核，嗜多染红细胞呈灰蓝色，成熟红细胞呈粉红色。典型的微核多为单个的、圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色，直径通常为红细胞的1/20～1/5。 （2）、实验流程： 购买小白鼠（体重为25g-35g，最好雌雄各半）组和对照组并对小鼠进行腹腔注射离心并涂片Giemsa染色后冲洗封片并观察、计数。 设置受试断颈制取骨髓 固定后保存 3．实验设备及材料 ： （1）、实验器材：显微镜、解剖剪、镊子、注射器、载玻片、树胶、盖玻片、塑料吸瓶、吸水纸及对苯二酚、秋水仙素、氯化、环磷酰胺、蒸馏水等； （2）试剂配置： ①小牛血清（灭活）: 将滤菌的小牛血清置于56℃恒温水浴保温30min灭活。灭活的小牛血清通常保存于冰箱冷冻室里； ②姬姆萨（Giemsa）原染液：将 Giemsa 染料3.8g置于研钵里研细，再加入甲醇至375mL和甘油125mL，混合均匀，放置37℃恒温箱中保温48h。保温期间，振摇数次，促使染料的充分溶解，取出过滤，两周后用； ③ Giemsa应用液：取2ml Giemsa染液与40ml 0.1mol/L磷酸盐缓冲液混合而成。临用现配； ④0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）:将已预先配置好的71.64g/L磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、31.21g/L磷酸二氢钠（NaH2PO4 ·2H2PO4）分别取51ml和49ml， 加入100ml蒸馏水并混合均匀。 4．实验方法步骤及注意事项 ： （1）实验步骤: ①选购小白鼠(体重为25g—35g)； ②剂量分组：受试物对苯二酚、秋水仙素、氯化汞分别设3个剂量，每个剂量组用5只小白鼠，各种受试物的剂量设置情况如下所示（单位mg/Kg）： 对苯二酚：120、80、40；秋水仙素：10、5、1；氯化汞：3、2、1。另外，用蒸馏水、环磷酰胺分别作为溶剂对照和阳性物对照组，其中环磷酰胺剂量可为40mg/kg； ③用腹腔注射24小时后，用断颈法处死小鼠。用剪刀剪开腿部的皮肤，用镊子夹住小鼠的股骨，将小鼠的两股骨取出，剪去和擦净股骨上的肌肉。剪去股骨的髋面，将吸有0.85% Nacl生理等渗液的注射器针头插入，反复几次吹洗出骨髓细胞并使其混合均匀，制成细胞悬液，再将细胞悬液在1000转/分离心5分钟，弃除上清液； ④向离心管中加入少量的小牛血清（约0.3ml)混匀后，按常规血涂片法涂片，长度约2cm—3cm，在空气中晾干。然后将干燥的涂片放入甲醇液中固定5min； ⑤将固定过的涂片放入Giemsa应用液中，染色20min—30min，然后立即用0.1mol/L磷酸盐缓冲液冲洗，用滤纸及时擦干染片背面的水滴，再用双层滤纸轻轻按压染片以吸附其上的残留水分，促其尽快晾干后放入二甲苯中透明5min，滴上适量光学树脂胶，盖上盖玻片后贴好标签； ⑥先后用低、高倍镜粗略检查，选择细胞分布均匀、细胞无损、着色适当的区域，再在油浸镜下对含微核的有核细胞进行计数； ⑦观察与计数：每只动物计数1000个嗜多染红细胞，观察含有微核的嗜多染红细胞数，微核率以千分率表示。统计所得数据可利用统计学软件SPSS的单因素方差分析或 t 检验等方法进行处理，并分析实验结果。 （2）、注意事项： ①在实验过程中应防止小牛血清受到污染，胸骨须擦拭干净，以免影响结果配； ②为保证Giemsa应用液的染色效果应该先用现配； ③在对离心之后最终得到的小鼠骨髓细胞悬液进行涂片时必须一次涂成，而且用力要轻,否则会使细胞受到损坏,而且涂片不要过厚或过薄，以免影响观察； ④对于制作好的骨髓细胞涂片即使当日不染色，也应该用Giemsa应用液固定后保存； ⑤对已经制作好的涂片进行制片质量的评定时，须以有核细胞形态、染色完好作为判断制片优劣的标准，观察时选择分布均匀、疏密适度、形态完整、染色好的区域镜检，由低倍镜到高倍镜，并按一定顺序镜检； ⑥此次实验用于制片透明的二甲苯为有毒物质，在透明的过程中要即使将盖子盖好，注意不要将其泼洒在实验桌或者沾到皮肤，若出现池中情况应该及时用自来水冲洗； ⑦最后在将涂片制成永久封片时，用注意所用的光学树脂胶应适量，过多容易使树胶溢出而容易沾在盖玻片表面而使制片清晰度下降，影响观察； ⑧注意微核与颗粒异物、嗜多染红细胞与其他骨髓细胞不同阶段血细胞的区分。 5．实验数据处理方法 ： 按照使用说明利用统计学软件SPSS的单因素方差分析方法对实验结果进行处理。 二、实验内容 1、实验现象与结果 ： （1）、微核试验数据统计总表： 受试物 对苯二酚 剂量 mg/Kg 120 80 40 秋水仙素 3 1.5 1 氯化汞 3 2 1 阴性对照蒸馏水 阳性对照环磷酰胺 40mg/kg体重 40mg/kg体重 组受试小鼠1000个受检细胞中含微核细胞数 别 1 2 3 4 5 6 7 8 1 38 33 2 28 31 3 20 25 1 36 33 2 29 25 3 24 21 1 22 25 2 16 22 3 13 17 1 3 2 35 30 21 32 23 23 20 21 15 1 45 37 32 23 34 26 20 26 19 16 4 40 34 29 28 35 24 19 21 20 14 3 36 35 28 26 31 27 25 23 18 15 5 41 36 33 24 31 25 22 22 17 17 3 43 30 27 22 37 24 19 18 15 13 9 39 合计 278 238 189 269 202 173 177 148 120 30 326 1 38 44 ⑵、根据上述实验结果经统计分析可得各组受试物微核千分率的相关情况： 受试物 剂量（mg/kg） 120 80 40 秋水仙素 3 1.5 1 氯化汞 3 2 1 阴性对照蒸馏水 40mg/kg体重 受检细胞含微核细胞总数数 （个） 8000 8000 8000 8000 8000 8000 8000 8000 8000 8000 8000 278 238 189 269 202 173 177 148 120 30 326 平均微核千分率（‰） 34.75 29.75 23.63 33.63 25.25 21.63 22.13 18.50 15.00 3.75 40.75 标准误 0.881 0.750 0.994 0.800 0.680 0.779 0.915 0.866 0.567 0.861 1.098 对苯二酚 阳性对照环磷酰胺 40mg/kg体重 2、对实验现象、实验结果的分析及其结论 ： (1) 实验现象（观察结果）： 将制作好的小鼠骨髓细胞微核涂片分别先后置于低、高倍镜下观察、识别小鼠骨髓细胞微核的形态及染色，可观察到其染色呈灰蓝色，嗜多染红细胞中的微核呈紫红色或蓝紫色的较小圆形、边缘光滑的微粒。其图片如下所示：