个人载体构建心得
这两年在美帝净做克隆实验了，以前读PHD时候还觉得自己分子克隆挺牛X的，来这边之后做了各种各样的构建才知道以前是坐井观天，刚才粗粗统计了一下，在美帝一年零八个月，我构建的质粒超过四百个，其中有很简单从PCR构建到拿WB结果的一共不到一周，也有巨难的花了四个月时间换了几次strategy才弄好激动得我半夜給老板发信的品种；有单片段酶切插入这种不用脑型的，也有九个片段逐一插入正反向还不同的。专家不敢说，但是熟能生巧，确实积累了不少经验，现在系里从POSTDOC到PHD学生到TECH构建前很多人都跟我商量（做博后结果成了技术员的人生真悲哀啊）。我老板甚至开玩笑说，我们将来开个公司，我专门负责构建（这话听得我想揍他大家同意不？）
想了想还是把经验写下来，一来做个记录，二来博同行一笑，能让大家少绕点弯路则更好。
1. 准备工作
俗话说用欲善其事，必先利其器。我强烈建议大家在做构建之前先找好工具，这样起的效果事半功倍。这里说个笑话，我们系有个新PHD学生，是个印度女孩，很聪明很刻苦，她所在的实验室也很好，不过除了她之外包括老板在内都是生物物理背景的，以前一个生物POSTDOC在的时候还好，这个POSTDOC一走，整个实验室对分生就只有一个粗浅的概念，这个女孩就想把一个质粒上的基因插到另一个质粒上去，要是我就先查查有没有合适的酶切位点，要没有就改造一下质粒一切搞定，这女孩她不懂啊（要命的是她老板固然牛，对这方面也不懂），自己辛辛苦苦设计了PCR引物去做PCR，P了将近5K的产物去测序，结果测的结果中间有个MUTATION，要懂行的就找找酶切位点，从原来的替换上去，然后测下这段就行。她呢，又送去了若干了质粒一个接一个的测，一个测序反应这边是8刀，一个质粒测下来就是40刀，她光测序就要花好几百刀（你得佩服老美实验室真有钱呀）。 这件事教育我们准备工作是多么重要！
这里推荐大家两个工具，一个都知道，PRIMER5.0。另一个工具极强大，也不知道国内流行不，叫lasergene，也就是DNAStar包括设计引物到构建图谱一应俱全，图谱非常漂亮，而且分析酶切位点等等就超NB，如果感兴趣的话我可以給大家传一个图谱看看。
2. PCR
如果没有现成的质粒可供酶切，PCR是最理想也是最方便的策略。关于PCR具体技术坛子内帖很多，我不多说了，这里仅在构建方面谈一谈。 如何设计引物？ 首先，看懂质粒图谱！
拿大家比较熟悉的PEGFP-C1和PEGFP-N1做例子。想用N1质粒，设计引物就得把下游引物上的中止密码子去掉，不要辛辛苦苦的一路做下来结果根本不表达融合蛋白，你就死了；C1质粒，注意frame，要是移码了，你也死了。而且PEGFP系列有1、2、3，要弄清楚别弄窜了。一句话，要看懂你的图谱！再多一句，PEGFP的XBA1和Bcl1位点不能用。 注意在设计酶切位点的时候要加保护碱基（大家要用T载体就当我没说）。酶切位点设计也有一定的讲究，我的原则是，能用粘端就用粘端，实在不能用的就用只好用一些常用的平端酶，如ECORV和SNAB1之类，要是以后还有别的用处就多加点酶切位点，我曾一口气在引物上加了五个酶切位点以防以后要用到，注意计算TM的时候要减去这些不match的序列，或者选用touch-up策略。
除了酶切位点，还要注意KOZAK序列的问题，很多质粒没有提供KOZAK序列，这要在设计的时候直接在引物上加好。
GENE OVERLAP也比较有用，比方说加个FLAG片段，HIS片段，2A序列之类的，直接设计三引物OVERLAP一下就可以，省得还要再多构建一步，这些都是设计引物时候就要考虑好的。
引物长一点不要紧（我最喜欢两步法了），尤其是对GC比高的序列，有时候引物不长PCR根本不出结果，注意如果GC比较高，这个时候GENE OVERLAP就不要做了，很麻烦，克隆很难挑。
没有合适的酶切位点？
很简单，用同尾酶策略，比方说Bgl2和BamH1，Nhe1和spe1，Xho1和Sal1（注意连上了切不下来），实在不行就平端吧，只要不超过4KB，平端酶连接也不那么难。 如何选择Taq酶？
选择Taq酶也很关键，首先，高保真（High fidelity）这是必须的，我在国内常用LA KIT，可这边***忑贵，只好用（美）国货。常用的PFU，PHUSION和PFX。PFX50是invitrogen公司的，一度曾卖到脱销，保真性应该是目前最高的，是普通Taq的50倍，对一般基因绝无问题（我同事4.5K PCR产物，居然一个突变都没有），但是对比较难PCR的高GC或者位点比较难做PCR的基因（基因组为模板）就明显不行了；PFU(安捷伦)保真性没有PFX50高，但是能力很强，略贵点；phusion是NEB公司的，不贵，但是这个酶很怪异，每次用都要把annealing温度调高好几度，否则就出杂带，个人觉得NEB内切酶绝对是NO.1，但是Taq就不如Invitrogen了，如果实验室有钱，直接买invitrogen的spuermix，什么都混好了，连ddH2o都搞定，只要直接向里加模版和引物就OK，每次我要拿漂亮的结果都用supermix。
还是那句话，读说明书。同是高保真Taq酶，iproof 要求98度起始1min，pfx就要求95起始2min ，延伸有的是72，有的是68，有的要加1uL，有的加0.5，有的TM要低五度，有的高三度，这些必须要读说明书，读且仔细读，这是拿到任何试剂都要做的第一步。 如果基因太难PCR，怎么办？
首先，DMSO是好物，好到甚至FISHER的Phusion就直接写上了DMSO这项，注意3%-6%，太高Taq酶活性就不行了。如果GC太高而且片段过长的话，DMSO也不行，GC低的不推荐。
我做个过一个2.8k，GC比高达92%的基因PCR，一共做了两周，从保真性最强的PFX50到普通的promega 2xGO Taq都试过，什么DMSO，甘油，Biorad的iproof with high GC Buffer， NEB one Taq 2x Taq High GC(还带Enhancer的)，TAKARA 的LA都试过，都不行，要么不出带，要么就是乱七八糟的带一起来，头晕脑涨的我都打算抹平策略了，后来从别的实验室弄来一个clontech的2 GC rich kit，一次搞定！强烈推荐这个KIT，太牛了，在别家都缴械的时候，它一锤定音，不过价格也比别家都牛，10次反应就130刀，其实实验室大可以备一个，就是防备超高GC又长的片段。不过这个KIT非高保真，送了三个克隆测序，各在不同部位有突变，于是我就从A克隆切一段接到B克隆上，又从C克隆切一段接B克隆上。注意的问题是：GC比太高测序也很困难，正常GC能测1K左右，到了High GC就能测个五六百，这时要多准备些引物。 PCR产物的纯化
如果带很单一，又强，直接PCR产物纯化就可以，如果有杂带，但目的带也很强，跑胶，目的带切胶回收。回收这里也有个瓶颈，就是回收率的问题，我试过很多家的KIT，promega的GEL回收试剂盒效率和价格都很合适，推荐这个。
关于T载体，我在国内的时候是必用的，到了美帝反倒一次没用过，这边比较流行直接用PCR产物切，就是回收完了直接切上，回收后然后连接，这又回到了最开始设计，要加保护碱基。这个策略好处就是免除了T载体这步，直接插入目的载体，存在的问题就是处于盲做状态，还要加保护碱基。
3. 酶切
我的原则一向是：尽量避免PCR，能酶切的多酶切，实在没办法才去PCR。
这里强烈推荐NEB的内切酶，还记得在有一次用别家的酶切过夜，结果质粒都被切碎了（当然当时质粒浓度也不高），而用NEB的酶，切个七十二小时仍旧一切OK，尤其现在NEB还推出了HF的内切酶，没有星活性而且统一都用Buffer4，很好用，在国内我都用TAKARA的酶，基本上还可以。