紫外线诱变选育α-淀粉高产菌株
一、实验目的
1.学习菌种的物理因素诱变育种基本技术。 2.通过诱变技术筛选出高产ɑ-淀粉酶的菌株。 二、实验原理
紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素，其诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成突变型。紫外线诱变，一般采用15W或30W紫外线灯，照射距离为20-30cm，照射时间依菌种而异，一般为1-3min，死亡率控制在50％-80％为宜。被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯种的出现。同时，对于细菌细胞的生理状态则要求培养至对数期为最好。本实验以紫外线处理产淀粉酶的枯草杆菌，通过透明圈法初筛，选择淀粉酶活力高的生产菌株。 三、实验材料
1. 菌种 产淀粉酶枯草芽孢杆菌
2. 器材 装有15W或30W紫外灯的超净工作台、电磁力搅拌器（含转子）、低速离心机、培养皿、涂布器、10mL离心管、（1、5、10mL）吸管、250mL三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球 3. 培养基和试剂
① 无菌水、75%酒精
② 0.5％碘液 碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘片全部溶解后，加足水即可。 ③ 选择培养基 可溶性淀粉2g，牛肉膏1g，NaCl 0.5g，琼脂2g，蒸馏水100mL，pH6.8～7.0，121℃灭菌20 min。
④ 肉汤培养基 牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，蒸馏水100mL ，pH7.2～7.4，121℃灭菌20 min。 四、实验步骤
1.菌体培养 取枯草芽孢杆菌一环接种于盛有20mL肉汤培养基的250mL三角瓶中，于37℃振荡培养12h，即为对数期的菌种。
2.菌悬液的制备 取5mL发酵液于10mL离心管中，以3000 r/min离心10min，弃去上清液。加入无菌水9mL，振荡洗涤，离心10min，弃去上清液。加入无菌水9mL，振荡均匀。 3.诱变处理 将菌悬液倾于无菌培养皿中（内放一个磁力搅拌棒），置电磁力搅拌器上于超净工作台紫外灯下（距离30cm）照射0.5-1min。
4.取0.1-0.2mL诱变后菌悬液于选择培养基平板上，用涂布器涂匀。置37℃暗箱培养48h。 5.在长出菌落的周围滴加碘液，观察并测定透明圈直径（C）和菌落直径（H），挑选C/H值最大者接入斜面保藏。
五、注意事项
1.紫外线对人体的细胞，尤其是人的眼睛和皮肤有伤害，长时间与紫外线接触会造成灼伤。故操作时要戴防护眼镜，操作尽量控制在防护罩内。
2.空气在紫外灯照射下，会产生臭氧，臭氧也有杀菌作用。臭氧过高，会引起人不舒服，同时也会影响菌体的成活率。臭氧在空气中的含量不能超过0.1％-1％。 六、结果与讨论
1.利用紫外诱变育种，应注意哪些因素?
2.为什么诱变育种后要挑选C/H值最 大者接入斜面保藏? 紫外线诱变处理的有效波长为200~300×10nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。dna和rna的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，dna分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响dna的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。
诱变在暗箱中进行。先将一定数量的种子用紫外线照射一段时间，然后再将种子培育出来，观察种子生长状况，发现产生了需要的性状后将该植株保留。注意：前期进行诱变的种子数量一定要多，因为种子发生突变的概率很小。
发酵工业是利用某种特定的微生物在一定的环境中进行新陈代谢，从而获得某种产品。现代发酵工业要求纯种培养，不仅斜面、种子和培养基以及发酵罐、管道等须经严格灭菌除去各种杂菌，而且在需氧发酵中通入的空气也需经过除菌处理。只有这样，才能确保生产不受杂菌污染，从而保证生产菌的旺盛生长。染菌的结果，轻者影响产量或产品质量，重者导致倒罐，甚至停产。工业发酵中污染杂菌造成的损失是十分惊人的，所以必须认真对待除菌。
发酵时感染杂菌，可引起下列后果：
1) 产生菌和杂菌同时在培养基中生长，结果丧失了生产能力；
2) 在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比产生菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为主了；
3) 杂菌会污染最终产品，如生产单细胞蛋白时，从发酵液中分离出的细胞夹杂有杂菌；
4) 杂菌所产生的物质，使目的产物的提取发生困难；
5) 杂菌降解了所需要的产物；
6) 发酵时如污染噬菌体，可使产生菌发生溶菌现象。
二 染菌的检查、原因分析和防治措施
1 染菌的检查与判断
1) 显微镜检查：通常用革兰氏染色法。先用低倍镜观察生产菌的特征，然后再用高倍镜观察是否有杂菌存在。根据生产均与杂菌的特征区别，判断是否染菌。必要时，可进行芽孢染色和鞭毛染色。
2) 平板划线培养或斜面培养检查法
3) 肉汤培养检查法：此法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，也可用于噬菌体检查，此时使用生产菌作为指示菌。
此外，还可以从发酵过程的异常现象来判断是否染菌，如溶解氧、pH值、排气中CO2含量和菌体酶活力等变化来判断。 2 发酵染菌率和染菌原因分析
发酵染菌率：指一年内发酵染菌的批数与总投料发酵批数之比。发酵染菌率是在发酵罐中发生的染菌率，种子罐培养时发生的染菌若不接入发酵罐、不导致发酵染菌的不在计算之列。
由于各种发酵的菌种、培养基、产品性质、发酵周期、生产环境条件、设备和管理技术水平等不同，染菌率有很大差别。 3 杂菌污染途径及预防
杂菌污染途径及预防
1) 种子带菌。原因主要有：培养基及用具灭菌不彻底；菌种在移接过程中受污染；菌种在培养或保藏过程中受污染等。
2) 无菌空气带菌。杜绝无菌空气带菌，必须从空气净化流程和设备的设计、过滤介质的选用和装填、过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。
3) 培养基和设备灭菌不彻底导致染菌。原因主要有：原料性状影响灭菌效果；实罐灭菌时未能充分排出罐内空气；培养基连续灭菌时，蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻底而污染；设备、管道存在“死角”。
4) 设备渗漏引起染菌。发酵设备、管道、阀门、的长期使用，由于腐蚀、磨擦和振动等原因，往往造成渗漏。
5) 操作失误和技术管理不善也会引起染菌。如移种时或发酵过程罐内压力跌零，使外界空气进入而染菌；泡沫顶盖而造成污染；压缩空气压力突然下降，使发酵液倒流入空气过滤器而造成污染等等。
对噬菌体的防治措施
1) 定期检查噬菌体并采取有效措施消灭噬菌体。当发酵生产中已经发现了噬菌体的危害后，应立即在车间的各个工段及发酵罐的空气过滤系统、发酵液和排气口、污水排放处以及车间周围的环境中进行取样检测，从中找出噬菌体较集中的地方继而采取相应的措施。如对种子室和摇床间可采用甲醛熏蒸及紫外线处理的方法消灭噬菌体和杂菌。对常用器皿及发酵罐体表面，可采用新洁而灭及石炭酸溶液喷雾或擦洗。发酵系统则可采取改进空气过滤装置和蒸汽灭菌的方法。
2) 检查生产系统，消除各种不安全因素。在发酵生产中，当连续发生噬菌体污染后，往往在空气过滤装置及发酵罐底部、内壁、夹层以及管道和阀门接口等处容易存在蒸汽不能直接进入灭菌的死角，必须及早查出隐患，定期更换空气过滤器中过滤材料并改进工艺和设备，杜绝发酵液中的活菌和可能存在的噬菌体向周围的环境排放，彻底消除各种不安全因素，保证生产的正常进行。
3) 选育抗噬菌体菌株和轮换使用生产菌株。选育抗噬菌体菌株是一种有效的手段，所获得的抗性菌株既要有较全面的抗性，并能保持原有的生产能力。对有的菌种在选育中很难做到既有抗性又能保持原有的生产能力。在可能情况下，针对噬菌体对侵染寄主具有专一性的特点，采用轮换使用生产菌株的方法，也可防止噬菌体的蔓延和危害，使生产得以正常进行。
4) 应急的挽救措施。在发酵生产中发现了噬菌体污染时，首先必须取样检查，并根据各种异常现象作出正确的判断，尽可能快地采取相应的挽救措施。常用的应急方法有以下几种：
① 加入少量药物用以阻止噬菌体吸附或抑制噬菌体蛋白质的合成及增殖。前者多系螯合剂如草酸及柠檬酸等；后者是一些抗生素，仅适用于耐药的生产菌株，由于成本较高，无法在较大的发酵罐中使用。
② 当生产进行中污染了噬菌体时，可补入适量的新鲜发酵培养基或促使菌种生长的生长因子（如玉米浆、酵母膏等），有利于菌种生长，抑制噬菌体的增殖，使发酵得以顺利进行。
③ 大量补接种子液或重新接种抗性菌种培养液，以便继续发酵制终点，防止倒灌，尽可能地减少因噬菌体污染所造成的损失。在补种之前也可对已感染了噬菌体的的发酵液低温灭菌。