紫外线诱变育种

紫外线诱变选育α-淀粉高产菌株

一、实验目的

1.学习菌种的物理因素诱变育种基本技术。 2.通过诱变技术筛选出高产ɑ-淀粉酶的菌株。 二、实验原理

紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素,其诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成突变型。紫外线诱变,一般采用15W或30W紫外线灯,照射距离为20-30cm,照射时间依菌种而异,一般为1-3min,死亡率控制在50%-80%为宜。被照射处理的细胞,必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态,以利于均匀接触诱变剂,并可减少不纯种的出现。同时,对于细菌细胞的生理状态则要求培养至对数期为最好。本实验以紫外线处理产淀粉酶的枯草杆菌,通过透明圈法初筛,选择淀粉酶活力高的生产菌株。 三、实验材料

1. 菌种 产淀粉酶枯草芽孢杆菌

2. 器材 装有15W或30W紫外灯的超净工作台、电磁力搅拌器(含转子)、低速离心机、培养皿、涂布器、10mL离心管、(1、5、10mL)吸管、250mL三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球 3. 培养基和试剂

① 无菌水、75%酒精

② 0.5%碘液 碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL,先将碘化钾溶解在少量水中,再将碘片溶解在碘化钾溶液中,待碘片全部溶解后,加足水即可。 ③ 选择培养基 可溶性淀粉2g,牛肉膏1g,NaCl 0.5g,琼脂2g,蒸馏水100mL,pH6.8~7.0,121℃灭菌20 min。

④ 肉汤培养基 牛肉膏0.5g,蛋白胨1g,NaCl 0.5g,蒸馏水100mL ,pH7.2~7.4,121℃灭菌20 min。 四、实验步骤

1.菌体培养 取枯草芽孢杆菌一环接种于盛有20mL肉汤培养基的250mL三角瓶中,于37℃振荡培养12h,即为对数期的菌种。

2.菌悬液的制备 取5mL发酵液于10mL离心管中,以3000 r/min离心10min,弃去上清液。加入无菌水9mL,振荡洗涤,离心10min,弃去上清液。加入无菌水9mL,振荡均匀。 3.诱变处理 将菌悬液倾于无菌培养皿中(内放一个磁力搅拌棒),置电磁力搅拌器上于超净工作台紫外灯下(距离30cm)照射0.5-1min。

4.取0.1-0.2mL诱变后菌悬液于选择培养基平板上,用涂布器涂匀。置37℃暗箱培养48h。 5.在长出菌落的周围滴加碘液,观察并测定透明圈直径(C)和菌落直径(H),挑选C/H值最大者接入斜面保藏。

五、注意事项

1.紫外线对人体的细胞,尤其是人的眼睛和皮肤有伤害,长时间与紫外线接触会造成灼伤。故操作时要戴防护眼镜,操作尽量控制在防护罩内。

2.空气在紫外灯照射下,会产生臭氧,臭氧也有杀菌作用。臭氧过高,会引起人不舒服,同时也会影响菌体的成活率。臭氧在空气中的含量不能超过0.1%-1%。 六、结果与讨论

1.利用紫外诱变育种,应注意哪些因素?

2.为什么诱变育种后要挑选C/H值最 大者接入斜面保藏? 紫外线诱变处理的有效波长为200~300×10nm,最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。dna和rna的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后,dna分子形成嘧啶二聚体,即两个相邻的嘧啶共价连接,二聚体出现会减弱双键间氢键的作用,并引起双链结构扭曲变形,阻碍碱基间的正常配对,从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成,会妨碍双链的解开,因而影响dna的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失,即是所谓的诱变。

诱变在暗箱中进行。先将一定数量的种子用紫外线照射一段时间,然后再将种子培育出来,观察种子生长状况,发现产生了需要的性状后将该植株保留。注意:前期进行诱变的种子数量一定要多,因为种子发生突变的概率很小。

发酵工业是利用某种特定的微生物在一定的环境中进行新陈代谢,从而获得某种产品。现代发酵工业要求纯种培养,不仅斜面、种子和培养基以及发酵罐、管道等须经严格灭菌除去各种杂菌,而且在需

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