【操作方法】
实验流程图：
大黄粉末20%H2SO4直火加热，抽滤，干燥 滤饼 乙醚索氏提取器回流提取 乙醚层5%NaHCO3
水层乙醚层 HCl5%Na2CO3 黄色沉淀水层乙醚层
HCl0.25%NaOH 大黄酸结晶黄色沉淀 水层乙醚层HCl 5%NaOH大黄素结晶 黄色沉淀 乙醚层水层 （回收）HCl芦荟大黄素结晶
浅黄色沉淀
（大黄酚 大黄素甲醚）
硅胶柱色谱 先洗脱下部分 后洗脱下部分 （大黄酚）（大黄素甲醚）
大黄酚结晶大黄素甲醚结晶1. 酸水解 用天平称取大黄粉末10g，置500mL烧杯中，加20%H2S04水溶液100mL，直火加热1小时，用布氏漏斗抽滤，过滤,水洗后于70℃左右干燥。
2. 总羟基蒽醌苷元的提取 滤饼经干燥后，置索氏提取器中，加入乙醚100mL，回流提取2小时，得乙醚提取液。乙醚提取液经薄层色谱检查有大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚和大黄酚。薄层板为硅胶CMC-Na板，展开剂为石油醚（沸程60~90℃）-乙酸乙酯 （7:3），近水平或直立展开，在可见光下可看到4个斑点，Rf≈0.9的黄色斑点为大黄酚和大黄素甲醚混合物，在此条件下分不开，其余3个斑点，依Rf值由大到小分别为大黄素（橙色斑点）、芦荟大黄素（黄色斑点）、大黄酸（黄色斑点）。
3. pH梯度萃取分离
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（1）大黄酸的分离和提纯：将上述乙醚提取液以5%碳酸氢钠溶液振荡提取，水层呈紫红色。分出水层，再重复提取数次，直至不显红色为止。合并水层提取液，用盐酸酸化至pH3左右，即得黄色沉淀。过滤，先用水洗沉淀数次，再以少量冰冷的丙酮洗以除去有色杂质。干燥后以冰醋酸或吡啶结晶2~3次，得黄色针状结晶。经熔点测定、纸色谱或薄层色谱，与标准品对照鉴定为大黄酸。 （2）大黄素的分离和提纯：碳酸氢钠溶液提取后的乙醚层再以5%碳酸钠溶液振荡提取数次，水层呈红色，合并水层提取液，加盐酸至酸性，得黄色沉淀，过滤，用水洗沉淀，以冰冷丙酮洗，在冰醋酸或吡啶中结晶数次，得橙色大针状结晶。经熔点测定、纸色谱或薄层色谱，与标准品对照鉴定为大黄素。 （3）芦荟大黄素的分离和提纯： 碳酸钠溶液提取后的乙醚层，再经0.25%氢氧化钠溶液振荡提取数次，水层呈红色，合并水层提取液，加盐酸至酸性，得橙色沉淀。过滤后用水洗沉淀，干燥后在冰醋酸或乙酸乙酯中结晶数次，得橙色长针状结晶。经熔点测定、纸色谱或薄层色谱鉴定为芦荟大黄素。
（4）大黄酚和大黄素甲醚的分离和提纯：上述芦荟大黄素分离后的乙醚液用5%氢氧化钠溶液振荡提取数次，直至元色。合并深红色的水层溶液，加盐酸至酸性，得黄色沉淀。过滤，水洗，干燥后得大黄酚和大黄素甲醚混合物。将此混合物溶于乙酸乙酯，用硅胶柱色谱分离。洗脱剂为石油醚（沸程60~90℃）-乙酸乙酯（15:1）混合液。先洗脱下的化合物为大黄酚，后洗脱下的化合物为大黄素甲醚，再分别经乙酸乙酯结晶纯化，两者经熔点测定、薄层色谱鉴定皆为纯品。
4. 硅胶柱色谱分离大黄酚和大黄素甲醚
（1）装柱：取100~200目硅胶约10g，按湿法装柱（柱床1.5cm × 8.5cm）； （2）加样：将提取物粉末（已备）溶解于5mL石油醚（沸程60~90℃）-乙酸乙酯（7:3）混合溶剂中，用吸管吸取样品溶液于色谱柱床顶端； （3）洗脱：用石油醚（沸程60~90℃）-乙酸乙酯（7:3）为洗脱剂洗脱，分段收集，每份10mL，用硅胶薄层板跟踪检查。 5. 实验产物结构鉴定的相关谱图示例以大黄素为例将相关图谱附在文后供参考，见附图 大黄素（Emodin）:IRνmax: 3462,3414,1628,1616,1400,1367,1136,1105,760cm-l；
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【注意事项】
1. 酸水解过程中加热时间应足够长，以保证水解充分。 2. 同一碱液提取时可分为几次萃取，以保证提取充分，可以用薄层色谱作监测。 3. 乙醚总提取物要用保鲜膜封严实，防止乙醚挥发。
【学习要求及思考题】
1. 掌握大黄蒽醌化合物的主要性质，酸性与结构的关系，重要的显色反应及其应用。
2. 掌握大黄蒽醌类成分的分离方法及其原理。 3. 如何检识中药中是否存在蒽醌类成分 ?
4. 比较大黄酸、大黄素及大黄素甲醚的酸性及在硅胶G吸附色谱板上的Rf值。
【参考文献】
1. 肖培根主编.新编中药志. 化学工业出版社,2002, 第一卷,66～67 2. 中华本草.上海科技出版社,1999, 第二册,第六卷,708～721
3. 王乃利,陈英杰.分离方法的改进与设计. 沈阳药学院学报,1979,(11),84～89 4. 陈琼华,戴汉松,苏学良.中药大黄的综合研究XXX I大黄蒽醌衍生物系统分离的改进方法.天然产物研究与开发,2001,13(3):58～60
5. 陈琼华.中药大黄的生物化学研究XXXX III大黄蒽醌衍生物系统分离的方法改进. 药物生物技术,1995,2(2):33～36
6. 李晓莹,黎知林.大黄中蒽醌类成分提取分离方法研究. 广东药学,1999,9(4),27～29
7. 姚新生主编. 天然药物化学（第三版）. 北京：人民卫生出版社,2001,143～166 8. 中国药科大学中草药化学教研室. 天然药物化学实验.1999,121～122
9. 王振月,李延冰,匡海学.毛脉酸模根中大黄酚、大黄素的分离鉴定.中医药学报,1996,(02),54
10. 李尚德,关雄泰.中国芦荟化学成分研究— 芦荟大黄素的分离与结构鉴定.广东微量元素科学,1994,1(2),52～54
11. 胡军,屠鹏飞,果德安. 秦岭大黄化学成分研究.西北药学杂志,1997,12(4),153～155
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实验二 槐花米中芦丁的提取、分离和鉴定
【简介】
芦丁也称芸香苷，广泛存在于植物界，其中在槐花米和莽麦叶中含量较高，可作为提取芦丁的原料。槲皮素即芸香苷苷元，可经芦丁水解制得。
槐花米系豆科植物的花蕾，古时用作止血药。槐花米的主要成分芸香苷有减少毛细血管通透性的作用，临床上主要为防治高血压的辅助治疗药物。此外，芦丁对于放射线伤害引起的出血症亦有一定的作用。 【目的】
1. 以芦丁为实例学习黄酮类成分的提取分离方法。
2. 掌握黄酮类成分的主要性质及黄酮苷、苷元和糖的鉴定。 【基本原理】 （槐花米中已知主要成分的理化性质）
1. 芦丁（芸香苷）
本品为淡黄色细小针状结晶，含3个结晶水，熔点177~178℃。芦丁溶于热水（1:200），难溶于冷水（1:8000）；溶于热甲醇（1:7），冷甲醇 （1:100）；热乙醇（1:30），冷乙醇（1:300），难溶于乙酸乙酯、丙酮，不溶于苯、氯仿、乙醚及石油醚等溶剂。易溶于碱液中呈黄色，酸化后又析出。
2. 槲皮素 即芸香苷苷元，为黄色结晶，熔点313~314℃。槲皮素溶于热乙醇 （1:23）, 冷乙醇（1:300）。可溶于冰醋酸、乙酸乙酯、丙酮等溶剂，不溶于石油醚、苯、乙醚、氯仿和水中。 【主要仪器及试剂】
1. 仪器
（1） 烧杯 （100mL，500mL） （2） 圆底烧瓶 （100 mL，150mL） （3） 冷凝管 （4） 抽滤瓶 （5） 循环水泵 （6） 紫外灯 2. 试剂
（1） 0.4% 硼砂水 （2） 石灰乳 （3） 乙醇，甲醇等 （4） 2% 硫酸，盐酸 （5） 氢氧化钡 （6） 三氯化铝 （7） 正丁醇 : 醋酸 : 水 （4:13 或 4:1:1）
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（8） 25% 醋酸，85% 醋酸，氨水 （9） 乙醇 : 水 （7﹕3） （10）标准品：芦丁，槲皮素 ，葡萄糖，鼠李糖 【操作方法】
1. 自槐花米中提取芦丁 （1） 提取方法
取槐花米20g，置于100mL烧杯中，加0.4% 硼砂水的沸腾溶液400mL，pH6~7左右，在搅拌下以石灰乳调至pH8，加热保持微沸30分钟，补充失去的水分，并保持pH8，静置5~10分钟，倾出上清液，用纱布过滤。重复提取一次，合并滤液，将滤液用盐酸调至pH5左右，再加8滴氯仿，放置过夜，抽滤，水洗3~4次，放置空气中自然干燥得粗芦丁。
（2） 芦丁的重结晶 取粗芦丁2g，加乙醇50~60mL加热溶解，趁热抽滤，将滤液浓缩至20~30mL，放置，析出结晶，母液再浓缩一半，又析出结晶。合并结晶，再用乙醇重结晶一次。
（3） 芦丁的水解
取芦丁1g，加2%H2S04 50 mL，小火加热微沸回流30分钟至1小时。开始加热10分钟为澄清溶液，逐渐析出黄色小针状结晶，即槲皮素，抽滤取结晶（保留滤液20mL，以检查其中所含单糖），加 50%乙醇15 mL加热回流使槲皮素粗晶溶解，趁热抽滤，放置析晶，抽滤得精制品，在减压下110 ℃干燥可得槲皮素无水物。测熔点，进行纸层析鉴定。
2. 芦丁、槲皮素及
糖的鉴定
（1）芦丁和槲皮素的聚酰胺薄层鉴定 样品：同纸层析
展开剂：乙醇 -水 （7:3） 显色：同纸层析
（2） 糖的检出——纸层析法
取上述滤除槲皮素时保留的水解滤液20mL，加 Ba(OH)2 的细粉2.6g，中和至pH7，滤除生成的BaSO4沉淀，滤液浓缩至1mL，供纸层析点样用。 展开剂：正丁醇-醋酸-水 （4:1:5上层或 4:1:1） 对照品：葡萄糖、鼠李糖水溶液
显色剂：苯胺苯二甲酸盐 （试剂喷后，105 ℃烘10分钟，显棕色或棕红色斑点。）
（3） 光谱鉴定 槲皮素 : IR（KBr cm-1）：3600~2800（broad，OH），1640（C=O），1500，1600（benzene）
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