HG miRNA SYBR Green PCR Kit HG miRNA荧光定量PCR试剂盒
Cat.No.:APXXXXX Size: 100次×20 μl
描述：HaiGene的HG miRNA SYBR Green PCR Kit使用Peter改良的miR-Q技术，采用特异性的上下游引物对反转录所得miRNA的cDNA产物进行定量检测【参考文献1】。不同于其它公司的单条特异性引物扩增方法，HaiGene采用双向特异性扩增引物（原理如图1），从而极大提高了miRNA的检测特异性，其可以区分极高相似度的miRNA分子、减少非特异性扩增（图2，3所示）。该试剂盒对可以对任何miRNA分子进行检测。HG miRNA荧光定量PCR试剂盒共有一万余种，试剂盒编号为APXXXXX，每一个miRNA分子对应一个检测试剂盒，可于HG miRNA qPCR kit.xls中查询。如果您研究的mircoRNA分子不在我们的列表中，请来信咨询，我们将及时给您优化设计。该试剂盒中的每一对引物均经过设计优化，确保扩增效率和特异性。使用该方法进行miRNA定量检测已被大量文献所采用【参考文献2～11】。
组分
名称 (100T×20 μl) 5×Golden HS SYBR Green qPCR Mix 400 μl 50×ROX Reference Dye 40 μl 20×miRNA Primer F 100 μl 20×miRNA Primer R 100 μl 储存：避光置于-20°C，可保存2年；避免反复冻融
常用内参HG miRNA荧光定量PCR试剂盒 内参名称 货号 适用物种 RNU6B AP01501 哺乳动物 RNU44 AP01502 人 RNU48 AP01503 人 SnoRNA135 AP01504 鼠 SnoRNA202 AP01505 鼠
注：其它miRNA荧光定量检测试剂盒见HG miRNA qPCR
kit.xls。
图1：Peter改良miR-Q检测原理图
图2：高效的扩增miRNAs
图3：有效的区分相似度很高的miRNAs
HG miRNA SYBR Green PCR Kit HG miRNA荧光定量PCR试剂盒
Cat.No.:APXXXXX Size: 100次×20 μl
操作方法
1. 按以下组分配制反转录反应液
microRNA（0.01-0.1 μg）or Total RNA 0.1-2 μg 4×One step miRNA RT Solution 5 μl *10×miRNA RT Primer 2 μl Rnase Free H2O Up to 20 μl
2. 在PCR仪上按以下条件进行反应: 37°C 60min 95°C 5min
3. 获得cDNA产物后使用HG miRNA荧光定量PCR试剂盒进行miRNA定量检测。
根据机型选择步骤A或B，配制反应体系
A: 需要添加ROX染料进行反应孔间信号矫正的Real-Time PCR仪，包括：ABI PRISM7000/7700/7900HT, 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR (Applied
Biosystems)；Mx3000P (Stratagene)等。按照如下组分配制20 μl PCR反应体系：
终浓度
5×Golden HS SYBR Green qPCR Mix 4 μl 1× 50×ROX Reference Dye 0.4 μl 1× PCR Forward Primer(20×) 1 μl 1× PCR Reverse Primer(20×) 1 μl 1× cDNA模板 1～2.5 μl ddH2O Up to 20 μl B:无需添加ROX染料进行反应孔间信号矫正的Real- Time PCR仪，包括：LightCycler (Roche Diagnostics)；MiniOpticon、Opticon2、MyiQ 2、CFX96 Real-Time PCR(Bio-Rad & MJ)；Line-Gene(Bioer，杭州博日)等。按照如下组分配制20μl PCR反应体系：
终浓度
5×Golden HS SYBR Green qPCR Mix 4 μl 1× PCR Forward Primer(20×) 1 μl 1× PCR Reverse Primer(20×) 1 μl 1× cDNA模板 1～2.5 μl ddH2O Up to 20 μl
4 进行Real-Time PCR反应, 通常采用两步法，程序如下： Stage 1: 95℃ 15min Stage 2: 95℃ 5s
60℃ 30s 30 ～40cycles Stage 3: Dissociation analysis
5. 扩增结果分析和数据处理
反应结束后确认Real-Time PCR的cDNA样品和NTC阴性对照的扩增曲线和融解曲线。
HG miRNA SYBR Green PCR Kit HG miRNA荧光定量PCR试剂盒
Cat.No.:APXXXXX Size: 100次×20 μl 参考文献
[1] Specific and sensitive quantitative RT-PCR of miRNAs with DNA primers. BMC Biotechnol. 2011 Jun 25; 11: 70. PMC3135530.
[2] Identification of circulating miRNA biomarkers based on global quantitative real-time PCR profiling. J Anim Sci Biotechnol. 2012 PMID:22958414.
[3] Reliable reference miRNAs for quantitative gene expression analysis of stress responses in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 2014. PMID:24656064.
[4] Profiling microRNAs in lung tissue from pigs infected with Actinobacillus pleuropneumoniae. BMC Genomics. 2012. PMID:22953717.
[5] The role of viral and host microRNAs in the Aujeszky's disease virus during the infection process. PLoS One. 2014. PMID:24475202.
[6] MicroRNA polymorphisms and environmental smoke exposure as risk factors for oesophageal squamous cell carcinoma. PLoS One. 2013.PMID:24205249.
[7] Plasma proANP and SDMA and microRNAs are associated with chronic mitral regurgitation in a pig model. Endocr Connect. 2013.PMID:24029364.
[8] Advances in microRNA experimental approaches to study physiological regulation of gene products implicated in CNS disorders. Exp Neurol. 2012. PMID:22245616.
[9] Maternally deposited germline piRNAs silence the tirant retrotransposon in somatic cells. EMBO Rep. 2013. PMID:23559065.
[10] miRNA expression profile analysis in kidney of different porcine breeds. PLoS One. 2013. PMID:23372853 [11] Determination of reference microRNAs for relative quantification in porcine tissues. PLoS One. 2012. PMID:22970213.