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【实验项目】
分子荧光法定量测定维生素B2的含量 【实验目的】
1. 掌握标准曲线法定量分析维生素B2的基本原理。
2. 了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能，掌握其基本操作。 【实验原理】
荧光是光致发光。任何荧光物质都具有激发光谱和发射光谱,发射波长总是大于激发波长。荧光激发光谱是通过测定荧光体的发光通量随波长变化而获得的光谱，反映不同波长激发光引起荧光的相对效率。荧光发射光谱是当荧光物质在固定的激发光源照射后所产生的分子荧光，是荧光强度对发射波长的关系曲线，表示在所发射的荧光中各种波长相对强度。由于各种不同的荧光物质有它们各自特定的荧光发射波长，可用它来鉴定荧光物质。有些发荧光的物质其荧光强度与物质的浓度成正比，故可用荧光分光光度法测定其含量。
维生素B2溶液在430~440nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535nm附近。维生素B2在pH＝6~7的溶液中荧光强度最大，而且其荧光强度与维生素B2溶液浓度呈线性关系，因此可以用荧光光谱法测维生素B2的含量。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为另一物质——光黄素，光黄素也是一个能发荧光的物质，其荧光比维生素B2的荧光强得多，故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。 在稀溶液中，荧光强度F与物质的浓度c有以下关系：
F＝2.303ФI0εbc
当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系：
F=Kc
【仪器与试剂】
1. 仪器：荧光分光光度计（型号：F2500 HITA[H]）；1cm石英比色
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页眉 皿；50mL容量瓶
2. 试剂：维生素B2标准溶液（10.0μg/mL）（已加乙酸）
【实验内容与步骤】
1.系列标准溶液和待测溶液的配制
取维生素B2（10.0μg/mL）标准溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL分别置于50mL的容量瓶中，标定，摇匀。取2.00mL待测溶液于50mL的容量瓶中，标定，摇匀。
2.激发光谱和荧光发射光谱的绘制（用3.00mLd的标准溶液）
设置λEm=520nm为发射波长，在250~400范围内扫描，记录发射波长强度和激发波长的关系曲线，便得到激发光谱。记录最大激发波长
设置λEx为最大激发波长即371nm，在400~600nm范围内扫描，记录发射强度与发射波长间的函数关系，便得到荧光发射光谱从荧光发射光谱上找出其最大的发射波长λEm和荧光强度。 3. 标准溶液及样品的荧光测定
将激发波长固定在371nm，荧光发射波长为521nm，测量上述系列标准溶液的荧光发射强度，按浓度从从低到高测定。
在同样条件下测定未知溶液的荧光强度，并由标准曲线确定未知试样中维生素B2的浓度。 【实验数据】
1.激发波长λEx=371nm 荧光发射波长λEm=521nm 2.标准溶液剂待测溶液的浓度和荧光强度记录
维生素B2溶液浓度（μg/mL） 相对荧光强度
可得待测溶液的浓度为0.393μg/mL.
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0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 待测溶液 26.70 51.76 75.35 98．81 121.0 50.38 页眉 【实验图像】
1.以λEm=520为发射波长，溶液浓度为0.6μg/mL，在250~400nm范围扫描得到的荧光强度和激发波长的关系曲线
3. 设置激发波长为371nm，溶液浓度为0.6μg/mL，在400~600nm范围内扫描，所得发射强度与发射波长间的荧光发射光谱如下：
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3.以激发波长λEx=371nm 荧光发射波长λEm=521nm，测量系列标准溶液浓度，以标准溶液的荧光发射强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，制作标准曲线如下：
【结果分析与讨论】
1.石英皿是四面透光的，拿的时候不能接触到四个透光面，只能拿上下角部，擦外壁残留液时由于擦镜纸不吸水，故可先用吸水纸巾擦干，再用擦镜纸擦。
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2.本次实验所得到的R值为0.99977，而理论R值为1，相关度很接近，说明准确度比较高，溶液配制比较准确。
3.配制好的溶液应尽快测量，避免久置成分变化而影响结果。 4.干扰荧光分光分光度法的因素：
(1)溶剂：同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质。溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强度增大。
(2)温度：升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。
(3)PH：大多数含有酸性或碱性取代基团的芳香族化合物的荧光性质受PH的影响很大。
(4)溶液表面活性剂的存在，减少非辐射跃迁的概率，提高了荧光效率。 (5)溶液中溶解氧的存在，由于氧分子的顺磁性质，使激发单重态分子向三重态的体系间窜跃速率加大，因而会使荧光效率降低。 【思考题】
1、试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因？
答：原因是由于现代电子技术具有检测十分微弱光信号的能力，并且荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度也可以增大荧光强度，使测定的灵敏度提高；而吸收光度法测定的是吸光度，不管是增大入射光强度，还是提高检测器的灵敏度，都会使透射光信号与入射光信号以同样的比例增大，吸光度值不会改变，因此灵敏度不能提高。
2、维生素B2在pH=6~7时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？
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