吸光值 平均值 查标准曲线得麦芽糖浓度 据公式算出酶活（麦芽糖mg/g鲜重5min）
α-淀粉酶酶活= 总淀粉酶酶活= 七、可溶性糖含量的测定
1.蒽酮法 1.1原理
糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在可见光吸收峰位620nm。
测定对象：几乎可以测定所有的碳水化合物，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应，所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量）。
1.2 步骤
试剂：(1)浓硫酸；
(2)蒽酮乙酸乙酯试剂：蒽酮------------1g 加乙酸乙酯至----50ml 实验步骤：
（1） 称取样品0.1g，置于研钵中，加4ml ddH2O研磨成匀浆，8ml ddH2O洗涤研钵。 （2） 100°C沸水浴10min，冰上冷却。 （3） 4000rpm离心10min。
（4） 取上清5ml转移至100ml容量瓶定容。
（5） 1ml提取液+ 1ml ddH2O+0.5ml蒽酮+5ml浓硫酸，轻轻混合均匀，100°C沸
水浴10min，冰上冷却。
（6） 620nm处测吸光值。 1.3 计算方法
可溶性糖含量% = C*V/(W*10^6)*100%
V为植物样品稀释后的体积（ml）------100ml
C为提取液的含糖量（μg/ml）--------根据标准曲线计算 W为植物组织鲜重量（g）-------------0.1g 问题及质疑： 1.目标糖含量：
标准曲线是用葡萄糖位标准制作的，而蒽酮法是测总糖的量，包括己糖、戊糖，浓硫酸将淀粉、纤维素水解成的单糖，将总糖得出的OD值代入由单一糖做出的标准曲线，有一定误差存在。注：查看所有文献的标准曲线都是用葡萄糖制作。 2.误差分析：
（1）不同糖类与蒽酮试剂反应的显色程度不同。果糖最深，葡萄糖次之， 半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖最浅造成误差。
（2）蒽酮试剂溶解度较低，非常容易析出，在反应时加入糖的水溶液中，出现浑浊现象，影响反应进行。（3）介于以上原因，将上清5ml转移至100ml容量瓶定容，稀释程度过大，当糖含量少的时候，大的误差可能会掩盖真实的糖含量。造成品数据没有实际意义。
方案修改意见：
1. 首先，做五到六组空白，测试分光光度计误差程度。
2. 增加平行组数，由三组增加至五组，减少每个样品测试次数。 改变测试样品定容量，由100ml变为50ml。
八、植物体内可溶性蛋白质含量的测定
植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。本实验将分别介绍这两种方法。
一、考马斯亮蓝法
【原理】
考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（0～100μg/ml），蛋白质－色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。
【仪器与用具】
分光光度计，10ml量筒1支；研体；10ml容量瓶1支；1ml刻度吸管3支；10ml具塞刻度试管14支。 【试剂】
（1）牛血清白蛋白 配成1000μg/ml和100μg/ml；
（2）考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%
（W/V）磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液在常温下可放置一个月； （3）90%乙醇；（4）磷酸（85%，W/V）。 【方法】 1.标准曲线的绘制
（1）0～100μg/ml标准曲线的制作 取6支试管，按表28-1数据配制0～100μg/ml血清白蛋白液各1ml。准确吸取所配各管溶液0.1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，放置2min后，在595nm下比色，绘制标准曲线。
表28-1 配制0～100μg/ml血清白蛋白液
管 号
100μg/ml牛血清蛋白量(ml)
蒸馏水量(ml) 蛋白质含量(mg)
1
2
3
4
5 0.8 0.2 0.08
6
0
1.0 0
0.2
0.8 0.02
0.4
0.6 0.04
0.6
0.4 0.06
1.0
0 0.10
（2）0～1000μg/ml标准曲线的制作 另取6支试管，按表28-2数据配制0～1000μg/ml牛血清白蛋白溶液各1ml。与步骤（1）操作相同，绘出0～1000μg/ml的标准曲线。
表28-2 配制0～1000μg/ml血清蛋白血液
管 号
1000μg/ml牛血清白蛋白（ml）
蒸馏水量(ml) 蛋白质含量(mg)
7 0 1.0 0
8 0.2 0.8 0.2
9 0.4 0.6 0.4
10 0.6 0.4 0.6
11 0.8 0.2 0.8
12 1.0 0 1.0
2.样品提取液中蛋白质浓度的测定 吸取样品提取液0.1ml（样品提取见各酶活测定），放入具塞刻度试管中（设两个重复管），加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后在595nm下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。 3.结果计算
C?Va样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=W
式中 C－查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；
V－提取液总体积（ml）； a－测定所取提取液体积（ml）； W－取样量（g）。
九、植物细胞质膜透性的测定
一、目的
植物细胞质膜是细胞与外界环境的一道分界面，对维持细胞的微环境和正常的代谢起着
重要作用。但植物常受到外界不良因子的影响，而不同植物种类其抗逆性则不同。用电导仪率法测定植物质膜透性的变化，可作为植物抗逆性的生理指标之一。本实验主要测定低温对
细胞质膜透性的影响，并掌握用电导仪法测定植物细胞质膜透性的原理及方法。
二、原理
植物细胞的细胞质由一层质膜包围着，这种质膜具有选择透性的独特功能。植物细胞与外界环境之间发生的一切物质交换都必须通过质膜进行。各种不良环境因素对细胞的影响往往首先作用于这层由类脂和蛋白质所构成的生物膜。如极端的温度、干旱、盐渍，重金属离
2＋
子（如Cd等）和大气污染物（如SO2、HF、O3）等都会使质膜受到不同程度的损伤，其表现往往为细胞膜透性增大，细胞内部分电解质外渗，外液电导率增大。该变化可用电导仪测定出来。细胞膜透性变得愈大，表示受害愈重，抗性愈弱，反之则抗性愈强。
三、材料、仪器设备
1.材料：植物叶片。
2.仪器设备：电导仪；电子天平；冰箱；真空泵；真空干燥器；恒温培养箱；电炉；50ml
烧杯；50ml量筒；小镊子；纱布；表皿；滤纸条；镜头纸；剪刀；玻棒；胶头滴管；瓷盘。
四、实验步骤
1.清洗用具
所用玻璃用具均需先用洗衣粉清洗，然后用自来水、蒸馏水洗3次，干燥后备用。
2.实验材料的准备及处理
选取叶龄相似的植物叶片，剪下后用湿布包住。实验时用自来水将供试叶片冲洗，除去
2
表面沾污物，再用蒸馏水冲洗1～2次，用干净纱布轻轻吸干叶片表面水分，然后剪成约1cm的小叶片（或用直径为1的打孔器钻取小园片），注意除掉大叶脉。将剪下的小叶片混合均匀，快速称取鲜样三份，每份1g，分别放入编号为A、B、C的三个烧杯中。作如下处理：
A杯放入冰箱0℃以下作低温处理，处理15～30min后取出（供试叶片也可以在实验前低温处理好待用，处理温度及时间依不同植物叶片耐寒性而定），加入蒸馏水50ml。
B杯常温处理，加入蒸馏水50ml。
将A、B二杯放入真空干燥器，用真空泵抽气20—30min（以抽出细胞间隙中的空气），然后缓缓放入空气，从真空干燥器中取出A、B杯。
C杯加入蒸馏水50ml，称重，盖上表皿，置于电炉上煮沸10～15min（煮沸时间依不同植物叶片而定），冷却后再称重并加蒸馏水至原重量，继续浸泡叶片。
将A、B、C三杯放置室温下浸提1 h左右（经常摇动，以有利电解质外渗）。然后将叶片从杯中夹出进行下一步测定。
3.电导率测定
用电导仪分别测定A、B、C三杯的电导率，同时测定蒸馏水（空白）的电导率（注意：每测定完一个样液后，用蒸馏水漂洗电极，再用滤纸将电极擦干，然后进行下一个样液的测定），所测得的结果记入下表：
电导率测定记录表
处理 蒸馏水（空白） A（低温） B（常温） 电导率(μS · cm) －1电解质的相对外渗率（％） C（煮沸）
五、结果计算
按下公式计算低温及常温处理电解质的相对外渗率：
处理电导率 － 空白电导率
电解质的相对外渗率（％）＝ —————————————— × 100 煮沸电导率 － 空白电导率
十、过氧化物酶活性的测定（比色法）
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在 470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量 470 nm 处的吸光度变化速率来测定过氧化物酶活性。 一、仪器、药品与材料 （一）实验材料 新鲜植物组织。 （二）仪器与用品
分光光度计，研钵，恒温水浴锅，100 mL 容量瓶，吸管，高速冷冻离心机，秒表，磁力搅拌器。 （三）试剂 １．愈创木酚。 ２．30％过氧化氢。
３．100 mmol/L 磷酸缓冲液 pH 6.0 （见附录7）。
４．反应混合液：取100 mmol/L 磷酸缓冲液（pH 6.0）50 mL 于烧杯中，加入愈创木酚28 μL，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入 30 % 过氧化氢 19 μL，混合均匀，保存于冰箱中备用。 二、实验步骤
1．称取植物材料 0.1 g ，剪碎，放入研钵中，加入适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，残渣再用 5 mL 磷酸缓冲液提取一次，以 4000 rpm 低温离心 15 min ，上清液即为粗酶液，定容至10 mL刻度，贮于低温下备用。
2．取2支试管，于1只中加入反应混合液 3 mL 和磷酸缓冲液1mL，作为对照，另1支中加入反应混合液3 mL和上述酶液1mL（如酶活性过高可稀释之）。迅速将两支试管中溶液混匀后，倒入比色杯，置于分光光度计样品室内，立即开启秒表记录时间，于470 nm 处测定吸光度（OD）值，每隔10S读数一次。 3．结果计算：以每分钟OD变化值（ΔA470 / gFW min）表示酶活性大小，。也可以用每min OD值变化0.01作为1个过氧化物酶活性单位（U）表示。
过氧化物酶活性（U/gFW·min）= ΔA470×VT/W×VS×0.01×t 式中：
ΔA470——反应时间内OD变化值。
VT ——提取酶液总体积（mL）。 W ——植物鲜重（g）。
Vs ——测定时取用酶液体积（mL）。 t ——反应时间（min）。