FISH检测 HER-2的意义
乳腺癌有效的治疗取决于正确的选择治疗方案，肿瘤专家研究发现HER-2的水平是以阿霉素为基础药物化疗重要而独立的预后因子。HER-2水平的检测被认为是选择乳腺癌化疗的标准依据。 HER-2水平的检测对乳腺癌治疗具有指导性意义。不准确的结果会造成不正确的治疗方案。导致病人遭受不必要的化疗或者使病人丧失有效的治疗良机。
HER-2/neu也称作CerbB-2，在调节细胞的生长中起着重要的作用，是分子量为185kd的转膜细胞受体，属于酪氨酸酶家族的成员。HER-2被证实在乳腺癌、卵巢癌和其它肿瘤上扩增和过表达。其扩增和过表达被认为是乳腺癌最重要预后和化疗标记。大约有25%-30%乳腺癌有HER-2基因扩增。
化疗是乳腺癌术后最重要的治疗方法之一，患者肿瘤HER-2扩增对以阿霉素为基础化疗的敏感性好，研究表明，HER-2扩增的病人实施强化剂量的化疗后其生存率明显提高。而对无HER-2扩增的病人没有那么好的效果。所以对无HER-2扩增的病人没有必要执行这样的化疗。准确的HER-2水平检测为正确选择治疗方案提供重要依据。
目前用于治疗乳腺癌的单克隆抗体Herceptin理论上只对细胞膜上过多HER-2蛋白表达的细胞才有作用，所以Herceptin治疗需要筛选HER-2阳性的患者才有可能成功。目前检测HER-2基因扩增或HER-2蛋白过度表达的方法有许多种，有南方点墨法、西方点墨法、北方点墨法、免疫组织化学染色法（IHC）和荧光原位杂交法（fluorescence in situ hybridization;FISH）等。目前DAKO Herceptin test，Vysis Path Vysion HER-2 DNA Probe试剂盒和Oncor INFORM HER-2/neu已通过美国食品药物管理局（FDA）的认证，目前被认为是比较可靠的方法。
IHC和FISH均可以使用福尔马林固定的组织蜡块来检测，和一般病理组织标本处理相同，病理存档的组织块也能用于HER-2的检测，因此目前实验室多数使用IHC和FISH来检测HER-2。Herceptin test 和FISH相比Herceptin test操作时间比较短，大约4-6个小时即可完成，而FISH需要隔夜完成。使用的设备Herceptin test只需要一般光学显微镜，FISH则需要使用荧光显微镜。从分子生物学原理上讲FISH检测的是肿瘤细胞的DNA，而Herceptin test（免疫化学法）检测的是细胞膜表面的蛋白质。实际上真正执行基因功能的物质是蛋白质而不是DNA，这要看HER-2基因是否扩增，当然以观察细胞膜表面HER-2蛋白质的量是否增加最为直接。也最为可信。因为有时即使DNA有扩增其结果未必能在蛋白质曾面表现出来。因为由DAN有表现到蛋白质被制造出来必须经过很多程序，中间可能出现很多干扰因素。除此之外，免疫化学检测法比较便宜，省时，可以较普遍的筛选。
FISH的优点在于使用传统分子生物学方法检测肿瘤组织的DNA。FISH在荧光显微镜下可以确认出肿瘤所在的位置，以Vysis Path Vysion HER-2 DNA Probe来说，它会把HER-2基因部位橘色荧光亮点，还将第17对染色体的中心颗粒（centromere）呈现绿色亮点，我们只要对比橘色和绿色亮点的数目，若橘色点/绿色点大于2，就表示有HER-2扩增，正常细胞橘色点/绿色点数目比值小于2。
FISH同IHC HER-2水平检测方法相比，IHC检测的准确性不如原位杂交（CISH）和原位荧光杂交法（FISH）。就各种检测方法比较FISH为最好，FISH检测的结果可靠，被喻为HER-2水平检测的金标准。
HER-2 免疫组织化学+2的意思是肿瘤组织在免疫组织化学染色下着色强度为2价。多数认为HER-2 +3（3价）具有临床意义，可以作为使用Herceptin治疗的依据。her-2 IHC+2则必须加作FISH检测是否真的有HER-2扩增。而HER-2 IHC 0或+1则表示没有没有HER-2
过表达，不必再作FISH，也不适合使用Herceptin治疗。
FISH检测方法
试剂和仪器
Vysis提供的材料
根据订货该盒内含有大约足够检测20，50和100人份试剂。限定一份检测22 x 22mm靶区。 1） LSI HER2/neu黄色光谱（low copy number E. coli vector）/CEP 17 绿光谱DNA探针
（E.coli plasmid）
Vysis P.N ( product number): 30-17060/35-171060
Quantity: 200uL/500uL/500uLx2 for the 100 assay kit Storage: -20℃ in the dark Composition (成分): SpetrumGreen fluorophore-labeled alpha satellite
DNA probe for chromosome 17, SpectrumOrange fluophore-labeled DNA probe for the HER-2/neu gen locus, and blocking DNA, pre-denatured in hybridization buffer.
2) DAPI Conuterstain
Vysis P.N: 30-804840/30-804860/30-804960 Quantity: 300uL/600uL/1000Ul
Storage: -20℃ in the dark Composition: 1000ng/mL DAPI (4,6-diamino-2phenylindole) in
phenylenediamine dihydrochloride, glycerol, and buffer.
3) N P-40
Vysis P.N: 30-804820
Quantity: 4mL (2 vials) Storage: -20 to 25℃ Composition: N P-40 4) 20 XSSC salts
Vysis P.N: 30-805850
Quantity: 66g for up to 250mLof 20 X SSC solution Storage: -20 to 25℃
Composition: sodium chloride and sodium citrate
Note: Material Safety Data Sheets (MSDS 材料安全数据表) for all reagents provided in the kits are available upon request from the Vysis Technical Department.
Storage and handling 贮存和处理
未开封的Path Vysis 试剂盒-20℃贮存并避光和潮湿。20 X SSC 盐和NP-40可以单独贮存于室温。每一种成分包装上面都标明了有效期。同时也标明了打开和未开包装的贮存条件。试剂盒中的某些成分接触光、热或潮湿会影响试剂的有效期，应该避免。不按包装规定的条件保存可能会影响检测结果。
需要的材料但Vysis公司不提供
实验室试剂
· HER-2/ nue探针检测正常对照（正常信号率）order No.30-805093
· 福尔马林固定，石蜡包埋，培养好的人细胞株（normal LSI HER-2/nue;CEP 17 ratio）
应用型显微镜载玻片数量：5片，对照片在15-30℃干燥剂防潮密封在容器中贮存。 · HER-2/ nue探针界限对照片（弱扩增信号率）order No.30-805042；福尔马林固定，
石蜡包埋。培养好的人细胞株（低水平HER-2/ nue扩增）应用型显微镜载玻片数量：5片，对照片在15-30℃干燥剂防潮密封在容器中贮存。 · 石蜡预处理试剂盒（Vysis cat.﹟32-801200）盒内包括： · 预处理液（NaSCN）数量：5 X 50mL
· 蛋白酶（胃蛋白酶2500-3000单位/mg）数量：5 X 25mg · 蛋白酶缓冲液（NaCl solution, pH 2）数量：5 X 50Ml · 缓冲洗液（2 X SSC，pH 7）数量：2 X 250mL · 中性缓冲福尔马林液（4%多聚甲醛PBS配制）
· Hemo-De ( 血液德)透明剂（Fisher product No.15-182-507A） · 苏木精和伊红（H&E）
· 适当的荧光显微镜浸泡油。室温贮存
· 超纯甲酰胺。从发货计算4℃保存1个月（查看生产商推荐的详细信息） · 100%乙醇。室温贮存 · 浓缩的（12N）盐酸 · 1N氢氧化钠
· 纯净水（蒸馏水或去离子水或Milli-Q）。室温贮存 · 橡胶水泥胶
· Drierite德里拉特[干燥用无水硫酸,商品名]和液氮
实验室设备
· 预清洁硅化或正电荷显微镜载玻片
· 载玻片加热器（要求有准确的温度数字显示）45-50℃ · 22 mm X 22 mm玻璃盖玻片
· 可调容积吸管（1-10 uL）和无菌微量移液管头 · 聚丙烯微量离心管（0.5-1.5mL ） · 计时器 · 切片机 · 磁力搅拌器 · 漩涡混合器 · 微量离心机 · 刻度量筒
· 水浴锅（37±1℃，72±1℃和80±1℃） · 水浴（40℃）无蛋白质 · 干燥箱（37℃-56℃） · 钻石笔 · 杂交湿盒 · 镊子
· 一次性注射器（5 mL）
· 染色缸（6）建议型号：Wheaton Product No.900620竖式染色缸