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实验二 萌发麦苗淀粉酶活性的测定
生物112 周泓兆 1102040226
一、研究背景及目的
酶作为生物体内最重要的催化剂，其活性尤其受到关注。在这次实验中，我们将对一些经典经典酶活力测定实验进行分析，对比其思路与设计差异，了解测定酶活力的基本方向和实验技巧。完成小麦萌发过程中淀粉酶活力的测定并分析测定结果是否合理。
二、原理
淀粉在淀粉酶的催化作用下生成麦芽糖。本实验便是通过测定淀粉酶在一定时间内分解淀粉所产生的麦芽糖总量来测定酶的活性。根据其催化产物的特点 和现有测定方法规定酶
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活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦芽糖毫克数（毫克麦芽糖*克鲜重*分）。
本实验涉及α-淀粉酶与β-淀粉酶，我们可通过钝化β-淀粉酶的方法单独测定α-淀粉酶的活性。
本实验所使用的3,5－二硝基水杨酸法是一种对还原糖定量测定的方法。还原糖和碱性二硝基水杨酸试剂一起共热，产生一种棕红色的氨基化合物，在一定的浓度范围内，棕红色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比。因此，我们可以测定样品中还原糖以及总糖的量。麦芽糖是还原性糖，可用该方法对其含量进行测定。
三、仪器与试剂
1.仪器：TDL-40B 离心机（上海安亭科学仪器厂），722 光栅分光光度计（上海精密科学 仪器有限公司） ，DK-S24 型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司），JP-100 架盘药 物天平（常熟市双杰测试仪器厂），HCTP12A1 架盘药物天平（北京医用天平厂）
2.试剂：麦芽糖标准液，pH5.6 的柠檬酸缓冲液 ，3,5-二硝基水杨酸溶液，0.4M NaOH， Folin-酚试剂甲，Folin-酚试剂乙，标准牛血清白蛋白溶液（1mg/ml ） 3.材料：萌发的小麦种子（芽长约1cm）
四、实验方法/操作步骤
1、酶液的制备：称取两克萌发的小麦种子（芽长一厘米左右），置研钵中加少量石英砂，以蒸馏水作为匀浆液，研磨成匀浆，转移到50ml容量瓶中至40ml左右，室温浸提15-20分钟，浸提充分后定容至刻度，混匀后3500r/min离心20min，取上清液备用（初始酶液）。 2、取15支试管，分别编号α-测定管1、α-测定管2、α-对照管1、α-对照管2、α+β-测定管1、α+β-测定管2、α+β-对照管1、α+β-对照管2与1、2、3、4、5、6、7。 3、在α-测定管1、α-测定管2、α-对照管1、α-对照管2中各加入酶液1ml在70℃恒温水浴中准确加热15min，取出后立即在冰浴中冷却至室温或更低。取出后分别在四支试管中各加入1mlpH5.6柠檬酸缓冲液，置于40℃恒温水浴中准确保温15min。之后向两支对照管中各加入4ml 0.4M NaOH，再向各管分别加入40℃下预热的淀粉溶液2ml，摇匀，立即于40℃水浴中准确保温5min，然后向两支测定管分别迅速加入4ml 0.4M NaOH，摇匀备用。
4、取制备的酶液5ml，放入100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混合均匀后，在α+β-测定管1、α+β-测定管2、α+β-对照管1、α+β-对照管2中各加入1ml稀释后的酶液与1mlpH5.6柠檬酸缓冲液置于40℃恒温水浴中准确保温15min。之后向两支对照管中各加入4ml 0.4M NaOH，再向各管分别加入40℃下预热的淀粉溶液2ml，摇匀，立即于40℃水浴
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中准确保温5min，然后向两支测定管分别迅速加入4ml 0.4M NaOH，摇匀备用。
5、取编号1、2、3、4、5、6、7的七支试管，分别加入麦芽糖标准液（1mg/ml）0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0ml，然后将各管用蒸馏水准确补充至1.0ml，摇匀。
6、在α-测定管1、α-测定管2、α-对照管1、α-对照管2、α+β-测定管1、α+β-测定管2、α+β-对照管1、α+β-对照管2与1、2、3、4、5、6、7管内各加入1ml 3,5二硝基水杨酸试剂混匀，同时在沸水浴中准确保温5min，取出冷却，用蒸馏水稀释到15ml，混匀。
7、依次取各试管溶液在520nm波长下进行比色，记录消光值。以1、2、3、4、5、6、7管消光值作为纵坐标，麦芽糖含量作为横坐标绘制标准曲线，根据标准曲线进行结果计算。 8、Folin-酚测萌发麦苗水溶性蛋白含量：称取0.5g萌发的小麦种子（芽长一厘米左右），置研钵中加少量石英砂，以蒸馏水作为匀浆液，研磨成匀浆，转移到50ml容量瓶中至40ml左右，室温浸提15-20分钟，浸提充分后定容至刻度，混匀后3500r/min离心20min，取上清液备用。
9、取9支具塞试管，分别标上待测液1、待测液2、待测液3与F1-F6。分别在F1-F6中加入标准 BSA 溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，然后将各管用蒸馏水补充到 1.0ml。再各取1ml上清液（步骤8）于标有待测液1、待测液2、待测液3的试管中。在这九支试管中各加试剂甲 5ml，混匀后室温下放置 10min，再加试剂乙 0.5ml，立即混匀，30min后测定各管的OD650。
五、数据整理
样品 管号 OD520 均值 管号 α-测定管1 0.296 α-测定管2 0.300 α-对照管1 0.159 α-对照管2 0.163 α+β-测定管1 0.342 α+β-测定管2 0.336 α+β-对照管1 0.191 α+β-对照管2 0.175 1 0.000 2 0.062 3 0.251 标准曲线 4 0.350 5 0.454 6 0.611 7 0.649 OD520 均值 0.298 0.161 0.339 0.183
样品 管号 OD650 均值 F1 0.000 F2 0.126 标准曲线 F3 0.269 F4 0.356 F5 0.461 F6 0.552 待测液1 0.556 待测液 待测液2 0.554 0.554 待测液3 0.551
六、结果计算与讨论分析
根据数据绘制标准曲线如下：
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根据标准曲线查得： 管号 α-测α-测定管1 定管2 0.445 α-对照管1 α-对照管2 α+β-测定管1 α+β-测定管2 α+β-对照管1 α+β-对照管2 麦芽糖浓度 （mg/ml） 0.241 0.507 0.274 结果计算：
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α-淀粉酶活性（毫克麦芽糖*克鲜重*分）=[(A-A')*样品稀释总体积]/[样品重（g）*5]
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=[(0.445-0.241)*800]/[2*5]=16.32（毫克麦芽糖*克鲜重*分）
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（α-+β-）淀粉酶总活性（毫克麦芽糖*克鲜重*分）=[(B-B')*样品稀释总体积]/[样品
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重（g）*5]=[(0.507-0.274)*8000]/[2*5]=186.4（毫克麦芽糖*克鲜重*分）
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