Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)

Trizol法使用步骤

一、分离纯化的基本原理

研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。RNA质量的高低常常影响cDNA库,RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶。

二、用户需自备的试剂和材料

无水乙醇、氯仿、Glycogen(可能需要)、 1.5ml Eppendorf管(RNase-free)、 Tips(RNase-free)

三、准备工作

RNase酶非常稳定,是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活,但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上,因此,在与RNA制备有关的分子生物学实验时,必须戴手套。

RNase的又一污染源是取液器,根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC(焦炭酸二磷脂,一种RNase抑制剂)配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部,基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。

1、 料制品的处理

尽可能使用无菌,一次性塑料制品,已标明RNase-Free 的塑料制品,如没有开

封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品,原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下:

1)在玻璃烧杯中注入去离子水,加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意:DEPC为剧毒物,活性很强,小心在通风柜中使用。

2)处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入DEPC水溶液,使塑料制品

的所有部分都浸泡到溶液中。 3)在通风柜中室温处理过夜。

4)将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯,高温高压蒸气灭菌至少30分钟。

5)烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。

2、 璃玻和金属物品

250°C烘烤3小时以上。

四、从组织中提取总RNA

1)液氮研磨:组织块直接放入研钵中,加入少量液氮,迅速研磨,待组织变软,再加少量液氮,再研磨,如此三次,按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol,转入离心管进行第2步操作。

(液氮既能使各种组织成分不易被破坏或降解,又能使组织变硬,脆性增加易于磨碎。终止细胞内外一切生物反应,防止RNA酶的降解反应)

2) 匀浆:组织样品按50-100mg/mlTrizol 加入Trizol。另外,组织体积不能超过Trizol体积的10%,否则匀浆效果会不好,用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。

五、从细胞中提取总RNA

1) 培养贴壁细胞:不须消化,可直接用Trizol进行消化、裂解,Trizol体积按10cm/ml比例加入。

2) 悬浮细胞可直接收集、裂解,每1ml Trizol可裂解5×10动物、植物或酵母细胞,或10细菌细胞。

六、操作步骤

1、细胞或组织加Trizol后,室温放置5min,使其充分裂解。注:此时可放入-70℃长期保持。

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2、12,000rpm 离心5min,弃沉淀。

3、按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿,振荡混匀后室温放置15min。注:禁用漩涡振荡器,以免基因组DNA断裂。

(氯仿为有机溶剂,有效的使有机相和无机相迅速分离。有机相中主要是酚和蛋白结合,从而使得蛋白和RNA脱离,RNA进入水相) 4、4℃ 12,000g离心15min。

5、吸取上层水相,至另一离心管中。注:千万不要吸取中间界面;若同时提取DNA和蛋白质,则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA,则弃下层酚相。

6、按0.5ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇(沉淀RNA)混匀,室温放置5-10min。 7、4℃ 12,000g离心10min,弃上清,RNA沉于管底。

8、按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇(沉淀RNA),温和振荡离心管,悬浮沉淀。

9、 4℃ 8,000g离心5min,尽量弃上清。

10、室温晾干或真空干燥5-10min。 注:RNA样品不要过于干燥,否则很难溶解。 11、可用50ul H2O,TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品,55-60℃,5-10min。注:H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。

(TE缓冲液由Tris和EDTA配制而成,主要用于溶解核酸,能稳定储存DNA和RNA。用于酶切反应不能使用SDS)

12、测O.D值定量RNA浓度。注:此方法提取RNA A260/A280值在1.6-1.8之间;产率估计:组织标本:(ug RNA/mg组织)1-10ug,培养细胞(ug RNA/10Cell):5-15ug。 注:组织或细胞量过少,可酌情减少Trizol用量;组织或细胞用量过多,会引起DNA对RNA的污染;

高蛋白、脂肪或多糖类组织,肌肉组织或块状植物组织等,组织匀浆或液氮研磨后须4℃ 12,000g离心10min去掉不溶物,再进行下面操作,若顶层有脂肪物,则也须去掉;

热天提RNA,带手套是必须的,手是RNase的主要来源;

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