负染色：荚膜染色法等
活菌：用美蓝或TTC（氧化三苯基四氮唑）等做活菌染色
思考题： 1、为什么说Koch等建立的微生物纯培养技术是微生物学建立与发展的基石？一般可用哪些方法获得微生物的纯培养？
2、微生物的最显著特征就是个体微小，通常只能通过显微镜进行观察。试列举在显微观察中通过改变样品的反差以改善观察效果的技术及方法。
11
第三章 微生物类群与形态结构 第一节 原核微生物
原核微生物的种类 : 真细菌 、放线菌、 蓝细菌、 支原体、
衣原体、 立克次氏体、古细菌
一、真细菌 （一）一般形态
基本形态：球状， 杆状， 螺旋状。 1、球状
细胞个体呈球形或椭圆形，不同种的球菌在细胞分裂时会形成不同的空间排列方式，常被作为分类依据。（金黄色葡萄球菌，淋病奈瑟氏球菌， 肺炎链球菌） 2、杆状
细胞呈杆状或圆柱形，一般其粗细（直径）比较稳定，而长度则常因培养时间、培养条件不同而有较大变化。
杆状细菌的排列方式常因生长阶段和培养条件而发生变化，一般不作为分类依据。 如：枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌， 铜绿假单胞菌， 炭疽杆菌，破伤风梭菌 3、螺旋状
弧菌 螺旋菌 螺旋体菌
弧菌：菌体只有一个弯曲，其程度不足一圈，形似“C”字或逗号，鞭毛偏端生。
如：霍乱弧菌， 寄生性弧菌-----蛭弧菌
螺旋菌：菌体回转如螺旋，螺旋数目和螺距大小因种而异，鞭毛二端生，细胞壁坚韧，菌体
较硬。
螺旋体菌：菌体柔软，用于运动的类似鞭毛的轴丝位于细胞外鞘内。如：梅毒密螺旋体 4、其它形状
1）柄杆菌（prosthecate bacteria） 细胞上有柄（stalk）、菌丝（hyphae）、附器（appendages）等细胞质伸出物，细胞呈杆状或梭状，并有特征性的细柄。
一般生活在淡水中固形物的表面，其异常形态使得菌体的表面积与体积之比增加，能有效地吸收有限的营养物；
2）星形细菌（star-shaped bacteria ） 3）方形细菌（square-ahaped bacteria） 4）异常形态
环境条件的变化： 物理、化学因子的刺激 阻碍细胞正常发育
培养时间过长 细胞衰老 环境条件恢复正常
营养缺乏 异常形态……………………正常形态…
自身代谢产物积累过多
（二）大小
最小：与无细胞结构的病毒相仿（50 nm；） 最大：肉眼可见（0.75 mm）；
费氏刺骨鱼菌(0.08 mm x 0.6 mm)(Epulopiscium fishelsoni)比大肠杆菌大100万倍（1985年发现）
12
德国科学家H. N. Schulz等1999年在纳米比亚海岸的海底沉积物中发现的一种硫
磺细菌（sulfur bacterium），其大小可达0.75 mm，Thiomargarita namibiensis，
---------“纳米比亚硫磺珍珠” 最大和最小细菌的个体大小悬殊：Thiomargarita namibiensis（0.75mm）是
T.nanobacteria（50 nm） 的10亿 ~ 100 亿倍。
一般细菌的大小范围：球菌 0.5 ~ 1 ?m （直径）
杆菌 0.2~ 1 ?m （直径） X 1~ 80 ?m（长度） 螺旋菌 0.3~ 1 ?m （直径） X 1~ 50 ?m（长度）
(长度是菌体两端点之间的距离，而非实际长度)
（三）细胞的结构与功能
一般构造：一般细菌都有的构造。
特殊构造：部分细菌具有的或一般细菌在特殊环境下才有的构造。 1、细胞壁
1）概念：细胞壁（cell wall）是位于细胞表面，内侧紧贴细胞膜的一层较为坚韧，略具弹性
的细胞结构。
2）证实细胞壁存在的方法：
（1）细菌超薄切片的电镜直接观察；
（2）质、壁分离与适当的染色，可以在光学显微镜下看到细胞壁； （3）机械法破裂细胞后，分离得到纯的细胞壁； （4）制备原生质体，观察细胞形态的变化； 3）细胞壁的功能：
（1）固定细胞外形和提高机械强度；
（2）为细胞的生长、分裂和鞭毛运动所必需；
（3）渗透屏障，阻拦酶蛋白和某些抗生素等大分子物质（分子量大于800）进入细胞，保
护细胞免受溶菌酶、消化酶和青霉素等有害物质的损伤；
（4）细菌特定的抗原性、致病性以及对抗生素和噬菌体的敏感性的物质基础； 4）革兰氏染色与细胞壁： （1）革兰氏染色
细菌染色法：死菌：正染色 ：简单染色法
鉴别染色法 革兰氏染色法 抗酸性染色法 芽孢染色法
死菌姬姆萨染色法 负染色： 荚膜染色法等
活菌：用美蓝或TTC（氧化三苯基四氮唑）等作活菌染色
革兰氏染色
1、用碱性染料结晶紫对菌悬液涂片进行初染；
2、用碘溶液进行媒染，其作用是提高染料和细胞间的相互作用从而使二者结合得更牢固； 3、用乙醇或丙酮冲洗进行脱色。在经历脱色后仍将结晶紫保留在细胞内的为革兰氏阳性细 菌，而革兰氏阴性细菌的结晶紫被洗掉，细胞呈无色；
4、用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对涂片进行复染。例如沙黄，它使原来无色的 革兰氏阴性细菌最后呈现桃红到红色，而革兰氏阳性细菌继续保持深紫色。
13
表3-1 革兰氏阳性和阴性细菌细胞壁成分的比较
成分 占细胞壁干重的%
革兰氏阳性细菌 革兰氏阴性细菌
肽聚糖 含量很高（50~90） 含量很低（~10）
磷壁酸 含量较高（＜50） 无
类脂质 一般无（＜2） 含量较高（~20） 蛋白质 无 含量较高
（2）革兰氏阳性细菌的细胞壁：
肽聚糖（90%）：聚糖
肽：四尾肽，肽桥 磷壁酸（10%）：壁磷壁酸，膜磷壁酸 周质空间
A、 肽聚糖(peptidoglycan)：
又称粘肽(mucopeptide)、胞壁质(murein)或粘质复合物 (mucocomplex)，是真细菌细胞壁中的特有成分。结合在革兰氏阳性细菌细胞壁上的一种酸性多糖
厚约20~80nm，由40层左右的网格状分子交织成的网套覆盖在整个细胞上。
双糖单位中的β-1,4-糖苷键很容易被溶菌酶(lysozyme)所水解，从而引起细菌因肽
聚糖细胞壁的“散架”而死亡。
目前所知的肽聚糖已超过100种，在这一“肽聚糖的多样性”中，主要的变化发生在肽桥上。 B、 磷壁酸：
革兰氏阳性细菌细胞壁上特有的化学成分，主要成分为甘油磷酸或核糖醇磷酸。 壁磷壁酸：与肽聚糖分子间进行共价结合，用稀酸或稀碱可以提取。跨越肽聚糖层并与细膜磷壁酸：与细胞膜相交联，又称脂磷壁酸，由甘油磷酸链分子与细胞膜上的磷脂进行共 价结合后形成，可用45%热酚水提取，也可用热水从脱脂的冻干细菌中提取。 主要生理功能：
①细胞壁形成负电荷环境，增强细胞膜对二价阳离子的吸收；
②二价阳离子，特别是高浓度的Mg2+的存在，对于保持膜的硬度，提高细胞膜上需
Mg2+的合成酶的活性极为重要；
③增强某些致病菌对宿主细胞的粘连、避免被白细胞吞噬以及抗补体的作用； ④革兰氏阳性细菌特异表面抗原的物质基础； ⑤噬菌体的特异性吸附受体；（可作为细菌分类、鉴定的依据） ⑥能调节细胞内自溶素(autolysin)的活力，防止细胞因自溶而死亡。 ⑦贮藏磷元素；
（3）革兰氏阴性细菌的细胞壁：
例如： 大肠杆菌 肽聚糖（<10%）；
外膜：脂多糖，磷脂 ；
外膜蛋白（脂蛋白，孔蛋白，其他未知蛋白 ）； 周质空间；
14
A、 肽聚糖：埋藏在外膜层之内，是仅由1~2层肽聚糖网状分子组成的薄层(2~3nm)；
含量约占细胞壁总重的10%，故对机械强度的抵抗力较革兰氏阳性菌弱； 没有特殊的肽桥，只形成较为疏稀、机械强度较差的肽聚糖网套； 具内消旋二氨基庚二酸(m-DAP)（只在原核微生物细胞壁上发现）；
B、外膜(outer membrane) :位于革兰氏阴性细菌细胞壁外层，由脂多糖、磷脂和脂蛋白等若
干种蛋白质组成的膜，有时也称为外壁。
脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）：位于革兰氏阴性细菌细胞壁最外层的一层较厚
（8~10nm）的类脂多糖类物质，由类脂A、核心多糖(core polysaccharide)和O-特异侧链（O-specific side chain，或称O-多糖或O-抗原）三部分组成。 脂多糖的主要功能：
①LPS结构的多变，决定了革兰氏阴性细菌细胞表面抗原决定簇的多样性；
②LPS负电荷较强，与磷壁酸相似，也有吸附Mg2+、Ca2+等阳离子以提高其在细
胞表面浓度的作用，对细胞膜结构起稳定作用。 ③具有控制某些物质进出细胞的部分选择性屏障功能； ④许多噬菌体在细胞表面的吸附受体；
⑤类脂A是革兰氏阴性细菌致病物质——内毒素的物质基础；
C、外膜蛋白(outer membrane protein)：嵌合在LPS和磷脂层外膜上的蛋白。
孔蛋白（porins）：是由三个相同分子量（36000）蛋白亚基组成的一种三聚体跨膜蛋白，
中间有一直径约1nm的孔道，通过孔的开、闭，可对进入外膜层的物质进行选择。
非特异性孔蛋白： 可通过分子量小于800~900的任何亲水性分子 特异性孔蛋白： 只容许一种或少数几种相关物质通过，如维生素B12和核苷酸等。 脂蛋白(lipoprotein)：是一种通过共价键使外膜层牢固地连接在肽聚糖内壁层上的蛋
白，分子量约为7200。
D、 周质空间(periplasmic space, periplasm)，又称壁膜间隙
在革兰氏阴性细菌中，一般指其外膜与细胞膜之间的狭窄空间（宽约12~15nm），呈胶状。
周质空间是进出细胞的物质的重要中转站和反应场所，在周质空间中，存在着多种周质蛋白（periplasmic proteins），如水解酶类；合成酶类；结合蛋白；受体蛋白。
革兰氏阳性和阴性细菌的比较
项 目 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌 1、革兰氏染色反应 能阻留结晶紫而染成紫色 可经脱色而复染成红色 2、肽聚糖层 厚，层次多 薄，一般单层 3、磷壁酸 多数含有 无 4、外膜 无 有 5、脂多糖（LPS） 无 有 6、类脂和脂蛋白含量 低（仅抗酸性细菌含类脂） 高 基体上着生两个环 基体上着生四个环 7、鞭毛结构 以外毒素为主 以内毒素为主 8、产毒素 强 弱 9、对机械力的抗性 弱 强 10、细胞壁抗溶菌酶 敏感 不敏感 11、对青霉素和磺胺
15