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实践三 病毒血凝和血凝抑制试验--（以新城疫为例）
实践目的：
1．掌握血凝（HA）和血凝抑制(HI)试验的原理 2．掌握鸡新城疫病毒血凝和血凝抑制试验的操作方法 实践原理：
某些病毒(如鸡新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与人或动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象。这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异性抗体（免疫血清）所抑制，即为红细胞凝集抑制试验。 实践内容：
1．红细胞凝集试验(HA试验) 主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数(抗原单位)。有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。
鸡新城疫病毒的HA试验现采用微量法，在V形微量反应板上进行。 (1)首先用微量移液器向每个孔加入稀释液即灭菌生理盐水一滴(25μl)。
(2)用微量移液器取病毒抗原液25μl加入第1孔内，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使病毒与稀释液混合均匀，再吸取25μl液体小心地移至第2孔，如此连续稀释至第11孔，第11孔吸取25μl液体弃掉；病毒稀释倍数依为1:2～1:2048，第12孔为红细胞对照。 (3)再以微量移液器每孔加1.0％红细胞悬浮液1滴(25μl)。
(4)在振荡器上振荡混匀约l～2分钟，再置37℃作用15分钟后观察结果。
(5)每次测定样品都应同时做红细胞对照。
表1 鸡新城疫血凝效价(HA)的测定术式(微量法)
孔号
病毒稀释倍数 生理盐水 病毒液
1
1:2
2
1:4
3
1:8
4
1:16
5
1:32
6
1:64
7
1:128
8
1:256
9
1:512
10
11
12
1:1024 1:2048 对照
25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl
弃去
1％红细胞悬液 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl
感作 置振荡器上混匀1～2分钟，放37℃静置15分钟 结果例示 # # # # # # # ++ - - - - # 表示100％完全凝集 ++ 表示50％凝集 - 表示不凝集
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结果判定：将反应板倾斜成45度角，沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。
能使100％红细胞凝集的病毒液的最高稀释倍数，称为该病毒液的红细胞凝集效价。如上例：病毒液的HA效价为1:128，HI试验时，病毒抗原液25微升内须含4个凝集单位，则应将原病毒液作成128/4＝32倍的稀释液。
2.红细胞凝集抑制试验(HI试验) 有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。
(1)用微量移液器每孔各加入1滴稀释液(即25μl)，从第1孔到第10孔。第1l孔加稀释液2滴(50μl)。
(2)以微量移液器取被检血清25μl，放入第1孔，，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使被检血清与稀释液混合均匀，再吸取25μl液体小心地移至第2孔，如此连续稀释至第10孔，最后第十孔吸取25μl液体弃掉；被检血清稀释倍数依为1:2～1:1024，第11孔为红细胞对照，第十二孔为抗原对照。
(3)每孔再加入含有四个单位的病毒液1滴(25μl)至第10孔，第1l孔为红细胞对照孔，不加病毒液；第十二孔为抗原对照，加病毒液。
(4)置振荡器上振荡l～2分钟后，放37℃静置20分钟。
(5)每孔再加入1.0％红细胞悬浮液1滴(25μl)放振荡器上振荡l～2分钟混匀，置37℃，15分钟后判定结果。
表2 鸡新城疫红细胞凝集抑制(H1)试验(微量法)
孔号 被检血清稀释倍数 生理盐水 被检血清
1 1:2
1:4
1:8
2
3
4
5
6
7
1:256
1:512
1:1024
红细胞 抗原 对照
对照
8
8
9
10
11
12
1:16 1:32 1:64 1:12
25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 50μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl
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弃掉
4单位病毒液 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl
25μl
振荡器上振荡1～2分钟，放37℃作用20分钟
1%红细胞悬液 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl
振荡器上振荡1～2分钟，放137℃作用15分钟
结果例示
- - - - - - - ++ # # - #
注： - 表示不凝集 、 ++ 表示部分凝集、 # 表示完全凝集 。
结果判定：将反应板倾斜成45度角，沉于管底的细细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。
能将4单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的红细胞凝集抑制效价，用被检血清的稀释倍数或以2为底的对数(10g2)表示。如上例，该血清的红细胞凝集抑制效价为1：128或HI效价为7(10g2)。
结果分析：
(1)一般认为鸡的免疫临界水平为1:8(成年)或1:16(雏鸡)，随地区不同而稍有差异。 (2)鸡血清HI抗体效价高于1:16时可适当推迟新城疫免疫的时间，HI抗体效价在1:16以下，须进行新城疫疫苗接疫种，在新城疫流行的地区或鸡场，鸡的免疫临界水平应稍提高。 (3)鸡群的HI抗体水平是以抽检样品的HI抗体效价(㏒2)的平均值表示的。
如果某鸡群的10份样品中，HI抗体效价(㏒2)为8的有3份样品，为7的有5份样品，为6的有2份样品，它们的平均值为：
8×3＋7×5＋6×2/3＋5＋2＝7.1平均水平在4(10g2)以上，说明该鸡群为免疫鸡群。若在检样中HI抗体效价的最高值与最低值相差太大时，则不能用上法计算平均水平，应根据临界水平以下的样品数在全部样品中所占的百分比决定免疫与否。
(4)大型养鸡场，每次进行抽测时，抽样率一般不低于0.1％一0.5％，小型鸡群，抽样率应有所增加，一般认为理想的抽样率应为2.0％。
(5)鸡群接种新城疫疫苗后，经2～3周测血清中的HI抗体效价，若提高2个滴度以上，表示鸡的免疫应答良好，疫苗接种成功；若HI抗体效价无明显提高，表示免疫失败。 作业：
1．每三位学生做一个血凝试验，测定出新城疫病毒的血凝效价，记录试验结果。 2．根据血凝价将新城疫病毒稀释成4个单位病毒液，每三位学生做一个血凝抑制试验，精品文档