11、染色
切片放入苏木精中染色约10~30min。染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低,适当缩短或延长。室温高时促进染色,染色时间可短些,否则可适当延长时间,冬季室温低时可放入恒温箱中染色。 12、水洗
用自来水流水冲洗约15min。冲洗过程中使切片颜色发蓝(或放入碱性水中也可,但用促蓝剂对伊红可能拒染,如果时间来得及,应以流水冲洗使切片显示蓝色为宜),但要注意流水不能过大,以防切片脱落,并随时用显微镜检查见颜色变蓝为止。 13、分化
就是将细胞质着的色褪去,使细胞核着色更加鲜明,也称分色。将切片放入1%盐酸乙醇液(盐酸1份+70%乙醇100份)中褪色,见切片变红,颜色较浅即可,约数秒至数十秒钟。这一步骤是H.E.染色成败的关键,,如分化不当会导致染色不匀,或深或浅,得到的切片染色效果差。如果染色适中,可取消此步骤。 14、漂洗
切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。低倍镜检查见细胞核呈蓝色、结构清楚;细胞质或结缔组织纤维成分无色为标准。然后放入蒸馏水中漂洗一次。 15、脱水Ⅰ
切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3~5min。 16、复染
用0.5%伊红乙醇液对比染色2~5min。伊红主要染细胞质,着色浓淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配合,如果细胞核染色较浓,细胞质也应浓染,以获得鲜明的对比。反之,如果细胞核染色较浅,细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染,促使细胞质容易着色,并且经乙醇脱水时不易褪色。 17、脱水Ⅱ
放入95%乙醇中洗去多余的红色,然后放入无水乙醇中3~5min。最后用吸水纸吸干多余的乙醇。 18、透明
切片放入二甲苯-乙醇等量混合液中约5min,然后放入纯二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3~5min。二甲苯应尽量保持无水,应经常更换,或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。切片如在二甲苯中出现白雾现象,说明脱水未尽,应退回乙醇中重新脱水,否则切片难以镜检。 19、封藏:中性树胶封存
切片经染色、脱水、透明后,即可用封藏剂将其封藏起来,目的是永久保存切片,便于镜检。常用的封藏剂一类为干性封藏剂如中性树胶、加拿大树胶等,另一类为湿性封藏剂如甘油明胶等。如果切片是经二甲苯透明,则用树胶作为封藏剂,树胶可以用二甲苯稀释至合适的稠度。如果切片是直接从水中或水溶液中取出,则常用甘油明胶作为封藏剂,可用于短期保存标本。
封藏的方法:
封片前应根据材料的大小,选用不同规格的盖玻片。材料透明后,按照下列方法进行封藏。在桌上放一张洁净的吸水纸,将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上(切片的一面向上),迅速地在切片的中央滴一滴树胶(千万不能待二甲苯干燥后再进行),用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧,稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角,然后再缓慢地将盖玻片放下,这样就可以减少或避免产生气泡。如胶液不足,可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。如胶液过多,可在干燥以后用刀刮去,并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。
染色结果:细胞核被苏木素染成蓝色,细胞质被伊红染色呈粉红色。 [实验报告]
1、简述石蜡切片的主要过程。 2、分析影响HE染色的主要因素。 石蜡切片法实例(二) ——番红-固绿对染法 一、目的要求
1、 熟悉植物石蜡切片的制作过程。
2、 掌握番红-固绿对染法的基本原理和具体方法。 二、实验原理
石蜡切片法也是在研究植物细胞的形态结构等方面常用的制片方法。它可以使植物材料切成薄的薄片,又可以切成连续薄片,切片经染色,观察效果甚好。番红-固绿对染法,为植物制片上最普遍的一种二重染色法,其染色程序简单并能清晰地显示出细胞的结构。番红为碱性染料,能使细胞核及木质化的细胞壁染成红色;固绿为酸性染料,能使细胞质及纤维素的细胞壁染成绿色。 三、实验用品 (一) 器材
切片刀,切片机,温箱,温台,解剖刀,镊子,单面刀片,台木,毛笔,蜡铲,酒精灯,包埋纸盒,染色缸,玻片盘,温度计,脸盆。 (二)试剂 FAA固定液,1%番红,1%固绿,各级酒精(30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%),二甲苯,石蜡,郝普特氏明胶粘片剂,树胶。 试剂配法:
1、FAA固定液(福尔马林-醋酸-洒精混合液) 福尔马林 5 ml
50%或70%的洒 90 ml 冰醋酸 5 ml
此液适用于植物组织,此液中的酒精,有用50%的,也有用70%的,一般薄嫩的材料右用50%的,厚硬的材料用70%的,醋酸的用量也可根据材料情况作适当的改变,对一些大块而密实的组织可增加用量,同时减少福尔马林的用量。固定时间可因材料及醋酸含量的变化而异,一般为5~20h。固定的材料,一般无需用水洗,可直接从70%的酒精开始脱水。 1、 1%番红
番红1g溶于100ml水中。 2、 1%固绿
1g固绿溶于100ml95%酒精中。 3、 郝普特氏明胶粘片剂 明胶 1g
蒸馏水 100ml 石炭酸 2g 甘油 15ml
配制时先将明胶溶解于30℃的蒸馏水中(在水浴锅内进行),待溶解后再加石炭酸和甘油,搅拌均匀后,趁热过滤,贮存于玻璃瓶中。 (三)材料
大豆、小麦、绿豆、洋葱、大蒜、蚕豆等。
三、实验程序 1、 取材
取已培养好的大豆、小麦、蚕豆根或茎、叶等用刀片将其尖端约1.2cm根尖切割下来,用刀片切割其成熟区部分成5mm长的小段(亦可切带侧根的部分),将切好的材料放入玻管中。
2、 固定
将FAA固定液倒入盛有材料的玻管中,固定时间为24h。 3、 冲洗
用70%酒精换洗3次,每次0.5-2h。 4、 脱水
80%、90%酒精各1-2h,纯酒精(中间换一次)1-2h。 5、 透明
等量纯酒精及二甲苯中1-2h,二甲苯(中间换一次)1-2h。 6、 透蜡 方法同前。 7、 包埋 方法同前。 8、 切片
根为横切面,其厚度为8~10um。 9、 贴片。 方法同前。
10、 番红-固绿对染法染色程序如下: (1)切片在二甲苯中脱蜡,约10min。 (2)等量纯酒精二甲苯5min。
(3)经纯酒精,95%、90%、80%、70%、505、305各级酒精各5min。 (4)蒸馏水2-5min。
(5)1%番红水溶液染色2h左右。 (6)用水洗去多余染液。
(7)50%、70%、80%、90%、95%各级酒精脱水10min。 (8)1%的固绿(用95%酒精配制)染色10-40s。 (9)95%酒精洗一下。 (10)纯酒精脱水5min。
(11)等量纯酒精二甲苯混合液中5min。 (12)二甲苯5min。 (13)中性树胶封藏。 注意:
(1)番红与固绿在酒精中很容易脱色,因此在酒精中脱水时,不能放置太久。
(2)用固绿对染之前应检查番红染色的是否合适,所染颜色应稍深一些,以防其在以后脱水步骤中仍会脱色,如果太浅,应退回重染。