实验一 光学显微镜的使用与微生物观察
第一节 普通光学显微镜的使用 一、实验目的
1、了解普通光学显微镜的基本构造和工作原理。
2、学习并掌握普通光学显微镜，重点是油镜的使用技术和维护知识。 3、在油镜下观察微生物的几种基本形态。 二、基本原理
（一）普通光学显微镜的构造
普通光学显微镜由机械系统和光学系统两部分组成（图1-1）。 1、机械系统
机械系统包括镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、调节器等。 （1）镜座：它是显微镜的基座，可使显微镜平稳地放置在平台上。 （2）镜臂：用以支持镜筒，也是移动显微镜时手握的部位。
（3）镜筒：它是连接接目镜（简称目镜）和接物镜（简称物镜）的金属圆筒。镜筒上端插入目镜，下端与物镜转换器相接。镜筒长度一般固定，通常是160mm。有些显微镜的镜筒长度可以调节。
（4）物镜转换器：它是一个用于安装物镜的圆盘，位于镜筒下端，其上装有3～5个不同放大倍数的物镜。为了使用方便，物镜一般按由低倍到高倍的顺序安装。转动物镜转换器可以选用合适的物镜。转换物镜时，必须用手旋转圆盘，切勿用手推动物镜，以免松脱物镜而招致损坏。
（5）载物台：载物台又称镜台，是放置标本的地方，呈方形或圆形。载物台上装有压片夹，可以固定被检标本；有标本移动器，转动螺旋可以使标本前后和左右移动。有些标本移动器上刻有标尺，可指示标本的位置，便于重复观察。
（6）调节器：调节器又称调焦装置，由粗调螺旋和细调螺旋组成，用于调节物镜与标本间的距离，使物像更清晰。粗调螺旋转动一圈可使镜筒升降约10mm，细调螺旋转动一圈可使镜筒升降约0.1mm。
图1-1 普通光学显微镜的构造
1. 镜座 2. 镜臂 3. 镜筒 4. 转换器 5. 载物台 6. 压片夹 7. 标本移动器 8. 粗调螺旋 9. 细调螺旋 10. 目镜 11. 物镜 12. 虹彩光阑（光圈） 13. 聚光器 14. 反光镜 2、光学系统
光学系统包括目镜、物镜、聚光器、反光镜等。
（1）目镜：它的功能是把物镜放大的物像再次放大。目镜一般由两块透镜组成。上面一块称接目透镜，下面一块称场镜。在两块透镜之间或在场镜下方有一光阑。由于光阑的大小决定着视野的大小，故它又称为视野光阑。标本成像于光阑限定的范围之内，在光阑上粘一小段细发可用作指针，指示视野中标本的位置。在进行显微测量时，目镜测微尺被安装在视野光阑上。目镜上刻有5×、10×、15×、20×等放大倍数。可按需选用。
（2）物镜：它的功能是把标本放大，产生物像。物镜可分为低倍镜（4或10×）、中倍镜（20×）、高倍镜（40～60×）和油镜（100×）。一般油镜上刻有“OI”（oil immersion）或HI（homogeneous immersion）字样，有时刻有一圈红线或黑线，以示区别。物镜上通常标有放大倍数、数值孔径（numerical aperture，简写为NA）、工作距离（物镜下端至盖玻片间的距离，mm）及盖玻片厚度等参数（图1-2）。以油镜为例，100/1.25分别表示放大倍数为100倍，NA为1.25；160/0.17分别表示镜筒长度160mm，盖玻片厚度等于或小于0.17mm。
图1-2 XSP-I6型显微镜物镜的主要参数
（3）聚光器：聚光器又称聚光镜，它的功能是把平行的光线聚焦于标本上，增强照明度。聚光器安装在镜台下，可上下移动。使用低倍物镜（简称低倍镜）时应降低聚光器，使用油镜时则应升高聚光器。聚光器上附有虹彩光阑（俗称光圈），通过调整光阑孔径的大小，可以调节进入物镜光线的强弱（物镜焦距、工作距离与光圈孔径之间的关系见图1-3）。在观察透明标本时，光圈宜调得相对小一些，这样虽会降低分辨力，但可增强反差，便于看清标本。
图1-3 物镜焦距、工作距离与光圈孔径之间的关系
（4）反光镜：它是普通光学显微镜的取光设备，其功能是采集光线，并将光线射向聚光器。反光镜安装在聚光器下方的镜座上，可以在水平与垂直两个方向上任意旋转。反光镜的一面是凹面镜，另一面是平面镜。一般情况下选用平面镜，光量不足时可换用凹面镜。 （二）普通光学显微镜的性能 1、数值孔径
数值孔径（NA）又称开口率，是指介质折射率与镜口角1/2正弦的乘积，可用式1-1表示。
NA?nsin?2 （1-1）
式中，n为物镜与标本之间介质的折射率，为镜口角（通过标本的光线延伸到物镜边缘所形成的夹角（图1-4）。
物镜的性能与物镜的数值孔径密切相关，数值孔径越大，物镜的性能越好。因为镜口角
?总是小于180?，所以sin2的最大值不可能超过1。又因为空气的
折射率为1，所以以空气为介质的数值孔径不可能大于1，一般为0.05～0.95。根据式1-1，要提高数值孔径，一个有效途径就是提高物镜与标本之间介质的折射率（图1-5）。使用香柏油（折射率为1.515）浸没物镜（即油镜）理论上可将数值孔径提高至1.5左右；实际数值孔径值也可达1.2～1.4。
图1-4 物镜的镜口角 图1-5 介质折射率对光线通路
的影响 2、分辨率
分辨率是指分辨物像细微结构的能力。分辨率常用可分辨出的物像两点间的最小距离（D）来表征（式1-2）。D值愈小，分辨率愈高。
D??2nsin?2
（1-2）
式中，λ为光波波长。