重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定
实验目的：
1. 学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核
酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
2. 学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。 3. 学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA
分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。 4. 掌握利用Cacl2 感受态细胞的方法。 5. 学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
6. 掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。并鉴定体外导入目的DNA片段的大
小。
7. 学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。
实验原理：
外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
1. 重组子的构建
酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有去最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成，在双酶切体系中，限制性内切酶在使用时应遵循“先
低盐后高盐，先低温后高温”的原则进行反应。
（要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量，以及相应的所需酶的量。可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10%，因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%，就会抑制酶的活性。）
连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA分子体外重组技术主要依赖限制性核算内切酶和DNA连接酶催化完成的。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-OH间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的T4 DNA连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体DNA和外源DNA的摩尔数之比控制在1:（1~3）之间，可以有效地解决DNA多拷贝插入的现象。反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是16℃，用常用的连接时间为12-16h。 2. 感受态细胞的制备及质粒转化
构建好的重组DNA转入感受态细胞中进行表达的现象就是转化。能进行转化的受体细胞必须是感受态细胞，即受体细胞最容易接受外源DNA片段实现转化的生理状态，它决定于受体菌的遗传特性，同时与菌龄、外界环境等因素有关。人工转化是通过人为诱导的方法使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内，该过程与细菌自身的遗传控制无关，常用热击法，电穿孔法等。能否实现质粒DNA的转化还与受体细胞的遗传特性有关，所用的受体细胞一般是限制修饰系统的缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法，制备好的感受态细胞可以加入终浓度为15%的无菌甘油，-70℃可保存半年至一年。经过CaCl2处理的细胞细胞膜通透性增加，允许外源DNA分子进入。在低温下，将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合，经过热击或电穿孔技术，使载体分子进入细胞。进入受体细胞的外源DNA分子通过复制、表达，使受体细胞出现新的遗传性状。将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养，即可筛选出重组子。本实验以E.coli DH 5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理，使其处于感受态，然后将重组后的PUC19质粒在42℃下热击90s，实现转化。 3. 重组子的筛选鉴定
重组DNA转化宿主细胞后，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖。并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们所期待的重组DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身
或一个载体与多个外源DNA片段形成非期待重组DNA分子导入所致。因此必须使用各种筛选及鉴定手段区分转化子与非转化子，并从转化的细胞群体中分理出带有目的基因的重组子。本实验中采用的方法是平板筛选法电泳筛选法及PCR检测方法。
抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选，而不含重组质粒DNA分子的受体菌则不能存活，α互补筛选法是根据菌落颜色筛选含有充足质粒的转化子。质粒PUC19携带有氨苄青霉素抗性基因（Amp）,在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子。没有导入质粒PUC19的受体细胞，在含有氨苄青霉素的平板上不生长。质粒PUC19进入E.coli DH 5α后，通过α-互补作用，形成完整的β-半乳糖苷酶。在麦康凯培养基平板上，转化子利用β-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养集中的指示剂变红，转化子的菌落变红。不含质粒的E.coli DH 5α，没有β-半乳糖苷酶活性，不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，而是利用培养集中的有机碳源，不使培养基pH降低，在不含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。重组后的载体DNA因为目的基因的插入位点在PUC19乳糖利用基因内部，不能形成α-互补作用，所以也不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。
挑选在氨苄青霉素培养基上生长的白色菌落，通过扩增培养。因为许多菌落存在假阳性情况，在氨苄青霉素培养基上的白色菌落可能是导入的重组载体DNA菌落，也可能是载体自连后发生突变的菌落，所以还要鉴定转化子中重组质粒DNA分子的大小，可将重组的载体DNA提取出来，进行后续的酶切、电泳检验。
也以提取的重组质粒为模板，利用现有的引物，进行那个PCR扩增，检测个噢偶见的质粒是否是所期望的重组质粒。 4. PCR技术
PCR（Polymerase chain reaction）即聚合酶链式反应，其原理类似于DNA的体内复制，又叫做“体外基因扩增”。反应体系包括：模板DNA、寡核苷酸引物、Mg，4种脱氧核糖核酸（dNTP）、DNA聚合酶和合适的缓冲体系。反应基本程序包括DNA变性、引物复性及引物延伸三个基本过程。这三个反应构成一个循环，反复进行。每一轮循环扩增的产物可作为下一轮扩增反应的模板。理论上每一轮循环可使DNA数量增加一倍，反复30次，特异DNA序列片段以指数方式可扩增10~10。通过此技术可以使非常微量的DNA产生大量的PCR产物，因此这个技术是一项在体外大量生产目的基因的技术。
现在普遍通用的是一种从水生嗜热杆菌中提取的Taq DNA聚合酶，而且大大提高了扩增片段的特异性、灵敏性和扩增效率。反应中用的引物有两段，一条称为上游引物或者正向引
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