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不同方法检测金盏花花粉生活力比较研究
作者：赵永平 张肖凌 魏玉杰 朱 亚 陈志国 常 瑛 来源：《现代农业科技》2008年第22期
摘要 为了选择一种快速测定金盏花花粉生活力的方法，对比研究了碘-碘化钾染色法、离体萌发法和活体萌发法。结果表明：碘-碘化钾染色法和活体萌发法都不适合检测金盏花花粉生活力，离体萌发法能够快速有效的测定花粉生活力，适合于金盏花及多数植物花粉生活力的快速检测。
关键词 金盏花；花粉萌发；花粉生活力；检测方法
中图分类号 S681.7文献标识码A文章编号1007-5739（2008）22-0013-02
金盏花（Calendula）别名万寿菊、臭芙蓉等[1]，菊科万寿菊属一年生草本植物，原产欧美洲各地，世界各地广泛栽培。随着世界各国对农产品纯天然、无公害标准的要求以及人们生活水平的提高，各国纷纷禁止使用人工化学合成的色素，而金盏花中的天然黄色素是纯绿色产品，不含任何有害物质，其不仅有着色功能，还具有营养、保健等功效，已被广泛应用于养殖业、食品、医药和化学工业等领域，是理想的天然色素原料[2]。在杂交育种过程中，花粉生活力是决定杂交结实的重要因素之一，因此，进行花粉生活力的测定对育种具有重要理论和现实意义[3]。目前，关于菊科花粉生活力测定的研究报道较多，其差异也较大，为此，笔者采用碘-碘化钾法、离体萌发法和活体萌发法对金盏花花粉生活力进行测定，以期筛选出一种快速测定花粉生活力的方法，为金盏花杂交育种提供保障。
1材料与方法
1.1试验材料
供试材料为本地栽培的金盏花品种SL-5，在晴天14时采集花粉，将花粉装于干燥的试管中，避光备用。 1.2试验方法
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1.2.1碘-碘化钾染色法。将0.3g碘和1.3g碘化钾溶解在蒸馏水中，再定容至100mL。取少量的花粉置于凹载玻片上，加水1滴，使花粉散开，再加1滴碘-碘化钾溶液，盖上盖玻片，置于30℃恒温箱中20~30min，然后在电子显微镜下观察，有生活力的花粉即被染成蓝色。 1.2.2离体萌发法。培养基用ME3的盐类和维生素，即MgSO4·7H2O 370mg/L、KNO3 950 mg/L、KH2PO4 85 mg/L、CaCl2·2H2O 880 mg/L、NH4NO3 412.5 mg/L、KCl 175 mg/L、H3BO3 50 mg/L、Na2EDTA 7.45 mg/L、FeSO4·7H2O 0.025mg/L、KI 0.83 mg/L、
Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L、CuSO4·5H2O 0.025 mg/L、CoCl2·6H2O 0.025 mg/L、V1.0mg/L和V1.0 mg/L，在此基础上加入16% PEG4000和12%蔗糖溶液为培养基[4]，室温黑暗条件下培养2h以上，在显微镜下检测花粉萌发速度和生长情况。花粉管长度大于花粉直径视为花粉萌发的标准，萌发率（%）=（萌发花粉数/花粉总数）×100，萌发花粉数和花粉总数以整个视野计，取3个视野的平均值。
1.2.3活体萌发法。取当天14时采集的新鲜花粉，在柱头最佳授粉时间授于标记的金盏花柱头，6h后取下柱头，固定，用8mol/L氢氧化钠软化脱色8h，再用0.1mol/L苯胺蓝溶液浸泡8h，用甘油压片，在荧光显微镜下观察[5]。
2结果与分析
2.1碘-碘化钾染色法测定金盏花花粉萌发率
通过显微镜观察（图1），金盏花花粉粒均为圆球状，外壁布满毛刺，直径为25~35um，但由于金盏花花粉粒的颜色为褐色或深褐色，染色后，整体颜色仅稍微变深，很难分辨花粉是否具有生活力，染色效果不够理想。由此可见，碘-碘化钾染色法不适合对金盏花等花粉颜色较深的植物进行花粉生活力的检测。 2.2离体萌发法测定金盏花花粉萌发率
代光明[3]研究认为用ME3+16% PEG4000+12%蔗糖溶液可使菊花的萌发率达到45%~80%左右，是目前研究出的离体萌发率最高的培养基，笔者按照此标准对金盏花花粉生活力进行检测，其3个重复的萌发率分别为48.8%、46.2%和49.1%，且花粉管生长良好，便于统计观察（图2）。金盏花花粉在离体萌发培养基上萌发2h内，其萌发率基本没有多大变化，但通过显微镜可以清楚的看到部分花粉外壁边缘有3处凹陷，形成3极。通过5h以上的培养，其花粉萌发率直线上升，花粉管伸长较快，之后就趋于稳定。离体萌发法检测金盏花花粉生活力简便易操作，并且检测结果直观，便于统计萌发率，是比较方便简捷的花粉生活力检测方法。 2.3活体萌发法测定金盏花花粉萌发率
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活体萌发法的花粉萌发率是用漂洗后花粉柱头上的花粉数目除以漂洗前的花粉数目来表示[6]。将当天收集的新鲜花粉采用点施和喷施2种方式授于标记过的柱头上，处理后通过显微镜观察均没有变化。因此，活体萌发法不适合用于测定金盏花花粉萌发情况。 3讨论
采用碘-碘化钾染色法进行花粉生活力测定具有快速简便的特点，但是受花粉自身特性如花粉壁薄厚、花粉外壁的组成物质以及花粉内各种酶活性等因素的影响较大，因此，染色法只适合于某些植物花粉生活力的测定。笔者通过碘-碘化钾染色法测定金盏花花粉萌发率发现，由于金盏花花粉粒颜色较深，染色后的花粉粒与未染色的花粉粒颜色相差无几，很难分辨，所以碘-碘化钾染色法不适合对金盏花花粉生活力进行检测，这与赵宏波等[6]研究的碘-碘化钾溶液、TTC溶液均不适宜对菊属植物花粉进行染色的报道一致。
在花粉离体萌发培养中，蔗糖起着维持花粉与培养基之间渗透平衡的作用，也是花粉萌发的营养物质和能量来源[7]，而PEG能使花粉内膜结构发生变化，改变膜表面电荷，使膜的柔软程度和通透性提高，从而促进花粉萌发和花粉管生长。所以笔者参照代光明、王四清、唐岱等[3，8，9]的研究，在ME3培养基的基础上加入16% PEG4000和12%蔗糖溶液，研究发现在培养5h后花粉萌发由上升转为稳定，花粉管生长良好，便于统计观察，花粉离体萌发试验的3个重复萌发率分别为48.8%、46.2%和49.1%，所以离体萌发法是测定花粉生活力较理想的方法，其操作快速，简捷，结果直观可靠，适合于绝大多数植物花粉生活力的检测。
活体萌发法测定花粉生活力与柱头发育情况、授粉时期以及花粉与柱头的亲和性等多种因素有关。笔者通过观察几乎没有发现花粉萌发，导致不能准确的统计萌发率，这可能是由于花粉在柱头软化染色过程中被漂洗掉或其他原因致使花粉没有感受到萌发信号。因为活体萌发法受到许多因子的制约，任何一个因素的变化都会在很大程度上影响柱头上花粉的萌发，从而影响花粉生活力测定的最终结果，所以活体萌发法不适合金盏花花粉生活力的测定。
通过试验我们初步认为用离体萌发法测定金盏花花粉萌发率比较方便，所测数据也真实可靠，是目前测定金盏花花粉生活力最有效的办法，至于对离体萌发法中培养基的筛选和各成分的作用还有待于进一步探讨。
4参考文献
[1] 陆桂军，齐成.万寿菊的引种栽培、繁殖与管理[J].新疆林业，2006（2）：37-38.