血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定实验报告

生物化学实验报告

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生物化学与分子生物学实验教学中心

实验名称 实验日期 合作者 评分 XX 血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定 实验地点 指导老师 教师签名 李某某 批改日期 2013-06-03 格式要求:正文请统一用:小四号,宋体,1.5倍行距;数字、英文用Times New

Roman;标题用:四号,黑体,加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出

现多行、多页空白现象。 一、实验目的

1、掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法。 2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法。 3、了解柱层析技术。

二、实验原理

1、粗提(盐析法):

蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素:表面的电荷和水化膜。当维持蛋白质的稳定因素破坏时,蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出。盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸引水分子,从而夺取蛋白质分子上的水化膜,还可中和部分电荷使蛋白质分子聚集而沉淀,从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。由于血清中各种蛋白质颗粒大小、所带电荷多少及亲水程度不同,因此,利用不同浓度的硫酸铵溶液分段盐析,便可将血清中清蛋白和球蛋白从溶液中沉淀出来,达到初步分离清蛋白、球蛋白的目的。 2、脱盐(凝胶层析法)

凝胶层析法利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过凝胶柱时,溶液中分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔进入凝胶颗粒,沿着凝胶颗粒间的间隙流动,

所以流程较短,向前移动速度较快,最先流出层析柱。而盐的分子量较小,可通过网孔进入凝胶颗粒,所以流程长,向前移动速度较慢,较晚流出层析柱。从而可达到去盐的目的。

3、纯化(离子交换层析法)

离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂;带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂,溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合,带正电荷的离子则不能,这样便可达到分离纯化的目的。

脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白,利用它们的等电点的不同可进行分离。血清中各种蛋白质的pI各不相同,因此,在同一醋酸铵缓冲液中,各蛋白质所带的电荷不同,可以通过DEAE离子交换层析将血清清蛋白和γ-球蛋白分离出来。 4、纯度鉴定(电泳)

采用醋酸纤维素薄膜电泳对分离得到的清蛋白和γ-球蛋白进行纯度鉴定,以正常血清样品作对照。比较两者电泳图谱可定性判断纯化的清蛋白和γ-球蛋白的纯度。

三、材料与方法:以流程图示意

材料:

1、样品:健康人血清(新鲜、无溶血、无沉淀物或细菌滋生)

2、试剂:0.3mol/L的PH6.5醋酸铵缓冲液、0.06mol/L的PH6.5醋酸铵缓冲液、0.02mol/L的PH6.5醋酸铵缓冲液、1.5mol/L的NaCl-0.3mol/NH4Ac溶液、饱和硫酸铵溶液、0.92mol/L(20%)磺基水杨酸、0.05mol/L(1%)BaCl2溶液、氨基黑染色液、巴比妥缓冲液、漂洗液。

3、仪器及器材:层析柱、烧杯、移液枪、加样枪、试管、滤纸、醋酸纤维素薄膜、黑色反应板、铁固定架、螺旋夹、离心管和离心机、培养皿、载玻片、滤纸、平头镊子、电泳槽、直流稳压电泳仪。

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