第十三章 免疫组织化学技术
免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。 第一节 概述
免疫组织化学的基本过程包括： ①抗原的提取与纯化；
②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化； ③将标志物与抗体结合形成标记抗体； ④标本的处理与制备；
⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应； ⑥观察结果。 一、标本的处理 （一）标本的主要来源
1.活体组织：应取材于病变组织及病变与正常组织交界处，大小适中。减少对组织标本的损伤与挤压。 2.体液、穿刺液：可直接涂片或经离心后取沉淀物涂片。
3.培养细胞：悬浮培养的细胞经离心沉淀后做细胞涂片，盖玻片上的单层培养细胞直接固定。 （二）标本的固定与保存
1.标本固定的目的：使细胞内蛋白质凝固，细胞内分解酶反应终止，以防止细胞自溶，保持细胞形态和结构；保存组织细胞抗原性；防止标本脱落；除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织腐败和在后续组织制备中的细胞结构和成分的改变。标本的固定应以不损伤细胞形态，不干扰固定后抗原的识别和结合为原则。
2.固定剂的选择：蛋白质类抗原，可用乙醇或甲醇固定；微生物抗原可用丙酮或三氯化碳固定；如需除去病毒的蛋白质外壳，可使用胰蛋白酶；多糖类抗原用10%福尔马林固定或以微火加热固定；如有黏液物质存在，应用透明质酸酶等处理除去；类脂质丰富的组织进行蛋白、多糖抗原检测时，需用有机溶剂（乙醚、丙酮等）处理除去类脂。组织标本常规固定液为中性缓冲甲醛。
3.制片方法的评价：冷冻和石蜡切片是免疫组化最常用的制片方法。首选冷冻切片。其操作简便，可避免石蜡切片因固定（甲醛）、脱水、浸蜡等对抗原所造成的损失，适用于不稳定的抗原。石蜡切片是研究形态学的主要制片方法，它不但是观察组织细胞结构的理想方法，而且可用在陈旧石蜡包埋材料免疫组化的回顾性研究。切片薄而有连续性，可长期保存。但对抗原的保存不如冷冻切片。 二、抗原的保存与修复 在制片过程中，由于广泛的蛋白交联可使组织中某些抗原决定簇发生遮蔽，致使抗原信号减弱或消失。抗原修复是使组织抗原决定簇重新暴露的过程。常用的抗原暴露、修复方法有：
酶消化法（无花果蛋白酶为轻度消化酶；胰蛋白酶为中度消化酶；胃蛋白酶为强消化酶。）；盐酸水解法；微波法；高压锅法（适用大批切片）；煮沸法。 三、抗体的处理与保存 （一）抗体的选择：多克隆抗体广泛用于石蜡包埋的组织切片，假阴性几率低，但特异性不如单克隆抗体，有时会造成抗体的交叉反应。单克隆抗体特异性强，但敏感性不够高。
（二）抗体的稀释：抗原抗体反应要求有正确的比例，过量或不足均不能达到预期结果。故需进行预实验，摸索抗体的最佳稀释度。
（三）抗体的保存：保存抗体时，要注意保持抗体的生物活性，防止抗体蛋白质变性，否则会降低抗体效价，甚至失效。
第 1 页 共 7 页
四、免疫组化的结果判断
（一）对照的设立：设立对照的目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，主要针对第一抗体进行，常用的对照有阳性对照和阴性对照。
（二）阳性结果：阳性细胞的显色分布有三种类型： ①细胞质； ②细胞核；
③细胞膜表面。免疫组织化学的呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。 （三）阴性结果及抗原不表达：阴性结果不能简单地认为具有否定意义，即使只有少数细胞阳性（只要是在抗原所在部位）也应视为阳性表达。
（四）特异性和非特异性显色的鉴别：特异性反应常分布于特定抗原部位，具有结构性，显色强度不一。非特异性反应无一定的分布规律，常为切片边缘、刀痕或皱褶部位，坏死或挤压的细胞区域，常成片均匀着色。
（五）免疫组化结果与苏木素-伊红染色（HE）切片结果：当免疫组化诊断结果与HE切片诊断不一致时，应结合临床资料综合分析，不能简单地用免疫组化检查结果推翻HE切片诊断。 五、质量控制
（一）试剂的质量控制：包括合适的稀释度、稀释剂、孵育温度和时间等。 （二）操作过程质量控制
（三）技术设备、仪器和器具的质量控制 第二节 免疫荧光组织化学技术
组织处理
（一）标本的类型：
1.涂片和印片：血液、细菌培养物、脑脊液、体腔渗出液和细胞悬液等均可简单地涂抹在玻片上，干燥固定后就可用于荧光抗体染色。脑脊液、脏器（肝、脾、淋巴结等）、细菌菌落或尸体病变组织可把新鲜切面压印于玻片上做成印片，经固定后再染色。 2.组织切片：最常用。包括：
①冷冻切片：首选的制片方法。优点：操作简单，组织的抗原性保存好，自发荧光较少，特异荧光强，同时适用于不稳定的抗原；缺点：组织结构欠清晰；
②石蜡切片：研究形态学的主要制片方法，它不但是观察组织结构的理想方法，而且可进行回顾性研究。其优点是组织细胞的精细结构显现清楚，但对抗原的保存量不如冷冻切片，并有组织自发荧光和非特异性荧光，需加酶消化处理。
3.细胞培养标本：细胞在玻片上培养，形成单层，固定后用作抗核抗体等检测的抗原片。还可使细胞单层生长在玻片上，再用病毒或患者标本感染，然后固定，用荧光抗体染色法检测病毒。
4.活细胞染色：检查淋巴细胞表面抗原以及免疫球蛋白受体、癌细胞表面抗原、血清中抗癌细胞抗体等，均可用活细胞荧光抗体染色法。当同时观察细胞表面两种抗原的分布和相互关系时，可用双标记法进行染色。
（二）标本的保存
标本在固定干燥后，最好立即进行荧光抗体染色及镜检。如必须保存时，则应保持干燥，置4℃以下保存。一般细菌涂片或器官组织切片经固定后可保存1个月以上。但病毒和某些组织抗原标本抗原性丧失很快，数天后就失去其抗原性，需在-20℃以下保存。 第三节 酶免疫组织化学技术
一、组织处理
第 2 页 共 7 页
主要用于标本中抗原（抗体）的定位和定性检测。常用的标本有组织切片、组织印片和细胞涂片等。该技术染色标本可长期保存，可用普通光镜观察结果，可观察组织细胞的细微结构等优点，尤其是非标记抗体酶免疫组化法的敏感性更优于荧光免疫技术。 二、酶标记抗体免疫组化染色
（一）直接法：将酶直接标记在特异性抗体上，与组织细胞内相应的抗原进行特异性反应，形成抗原-抗体-酶复合物，最后用酶底物显色。直接法的优点在于操作简便及特异性强，缺点是敏感性低，制备的抗体种类有限。
（二）间接法：将酶标记在第二抗体上，先将第一抗体（特异性抗体）与相应的组织抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用第二抗体（酶标记的抗体）与复合物中的特异性抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。间接法的优点是检测敏感性高，制备一种酶标二抗可用于检测多种抗原或抗体。缺点是特异性不如直接法，而且操作较为繁琐。 三、非标记抗体免疫酶组化染色 酶不是标记在抗体上，而是首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，通过免疫学反应将抗酶抗体与组织抗原联系在一起。该方法避免了酶标记时对抗体的损伤，同时也提高了方法的敏感性。 （一）酶桥法：抗酶抗体作为第三抗体，通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与第三抗体连接起来，形成酶联的抗原-抗体复合物，加底物显色。
（二）PAP法：PAP法是在酶桥法基础上的改良。PAP法首先将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶组成可溶性复合物（PAP复合物）。该复合物由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组成，呈五角形结构，非常稳定。通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与PAP复合物的抗酶抗体连接起来，此时要求特异性第一抗体与第三抗体的动物种属相同。
（三）双桥PAP法：在PAP法中通过两次连接桥抗体和PAP复合物而建立起来的，通过双桥可结合更多的PAP复合物于抗原分子上，以增强敏感性。这种放大方式重复使用桥抗体，使桥抗体与PAP复合物中抗酶抗体的未充分饱和Fc段结合，或桥抗体与特异性第一抗体尚未饱和的Fc段结合。 （四）碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法（APAAP法） 辣根过氧化物酶（HRP）是免疫组化的首选用酶，但有些组织细胞含内源性过氧化物酶限制了HRP的广泛应用，尽管用甲醇过氧化氢进行处理可以抑制内源性过氧化物酶活性，但同时也会影响抗原的显示。 APAAP法就是用碱性磷酸酶代替HRP建立的碱性磷酸酶（AP）-抗碱性磷酸酶（AAP）法，即简称APAAP。 四、酶免疫组化染色中常用的酶及显色底物
酶免疫组化技术中最常用的酶是辣根过氧化物酶，常用的供氢体有二氨基联苯胺（DAB），反应产物呈棕色；氨基乙基卡巴唑（AEC），反应产物呈橘红色；4-氯-1-萘酚，反应产物为灰蓝色。
对含有丰富内源性过氧化物酶的组织切片（如淋巴组织和肿瘤组织），则首选AP标记的免疫组化方法。理论上AP最为敏感，但HRP比AP染色结果保存时间长。 第四节 亲和组织化学染色
一、生物素-亲和素法 生物素即维生素H，是一种碱性蛋白。亲和素具有4个与生物素亲和力极高的结合位点。能够彼此牢固结合而不影响彼此的生物学活性。常用的技术类型有： （一）亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术（ABC）
原理：亲和素与酶标生物素结合，形成可溶性亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）。其与生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体（间接法）相遇时，ABC中未饱和的亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合。
优点：敏感性高、亲和力强、特异性高、抗体工作浓度低、操作时间短、可以多重标记等。
第 3 页 共 7 页
（二）桥联亲和素-生物素技术（BRAB技术）
以游离的亲和素作为桥联剂，将检测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素（如酶标生物素）联结起来，达到检测反应分子的目的。 （三）标记亲和素-生物素技术（LAB技术）
以标记亲和素直接与免疫复合物中的生物素化抗体连接进行检测。该法具有相当高的灵敏度。 间接LAB法采用的是生物素化的第二抗体，可以进一步提高检测灵敏度。 二、葡萄球菌A蛋白法 根据SPA能与多种动物IgG的Fc段结合的原理，用SPA标志物（酶、荧光素、放射性物质等）显示抗原与抗体结合反应的免疫检测实验。SPA常用HRP标记，可应用于间接法。SPA法的染色程序基本同酶标抗体法，仅第二抗体改用SPA-HRP。 三、凝集素法 ①直接法：将标志物直接结合在凝集素上，使其与组织细胞相应的糖蛋白或糖脂相结合；
②间接法：先将凝集素与组织细胞膜糖基结合，然后再用标记的抗凝集素抗体（即用凝集素免疫动物制备抗凝集素抗体）与结合在细胞上的凝集素反应。间接法还有糖-凝集素-糖法，该方法是利用生物细胞膜的特殊糖基与凝集素结合后，再用标记的已知糖基与其反应，形成一个“三明治样”结合物。 四、链霉亲和素-生物素法
链霉亲和素（SA）是从链霉菌培养物提取的一种纯蛋白，有4个生物素结合位点，并且具有高度的亲和力。利用生物素结合的第二抗体与酶标记的链霉亲和素蛋白就构成了酶标链霉亲和素-生物素方法（LSAB）。
其敏感性高；低背景着色；第一抗体工作浓度低；操作简便。 第五节 免疫标记电镜技术
一、免疫标记电镜技术标本制备的要求 为保持组织的抗原性，固定剂不宜过强。
1.包埋前染色 优点是切片染色前不经过锇酸固定、脱水及树脂包埋等过程，抗原未被破坏，易于获得良好的免疫反应。特别适用于含抗原量较少的组织。
2.包埋后染色 优点是超微结构保存较好，方法简便，阳性结构有高度的可重复性，能在同一张切片上进行多重免疫染色。但抗原活性可能减弱，甚至丧失或者抗原性质发生改变。
3.超薄切片免疫染色 是将组织置于2.3mol/L蔗糖液中，以液氮速冻，冷冻切片。由于不需经固定、脱水、包埋等步骤，直接进行免疫染色，所以抗原性保存较好，兼有包埋前和包埋后染色的优点。 二、常用的免疫标记电镜技术 （一）免疫胶体金染色法：以胶体金作为示踪标志物，颗粒在5～20nm之间，呈葡萄酒红色；20～40nm之间，呈深红色；颗粒为60nm，呈蓝紫色；若离心去掉较大的金颗粒后，溶胶呈红色。
既可用于透射电镜（TEM）又可用于扫描电镜（SEM），其最大的优点就是可以通过应用不同大小的颗粒或结合酶标进行双重或多重标记。
（二）免疫胶体铁细胞化学染色法：胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通过普鲁士蓝反应呈色，可用在电镜和光镜水平上的抗原（抗体）定位研究。
（三）酶免疫电镜技术：是利用酶的高效率催化作用，对其底物的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察，通过对酶的定位，对抗原（抗体）进行定位。 第六节 免疫组织化学技术的应用
第 4 页 共 7 页